甘草對雄性小鼠睪丸生殖毒性的影響

孫新明肖鶯1周劍莉楊亞軍楊贛軍胡紅梅孫弋

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部，江西吉安343009)

摘要〔〕目的探討甘草對雄鼠睪丸生殖毒性的影響。方法對給以甘草制劑的母鼠所產(chǎn)雄性后代及給藥雄性個體的生殖行為和配種能力、血液睪酮濃度、睪丸指數(shù)及組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行測評,并檢測給藥對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)及其分泌睪酮的影響。結(jié)果長時間內(nèi)服450 mg甘草提取物/kg體重對雄鼠的性行為和配種能力產(chǎn)生一定程度的影響，對雄性鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)及其分泌睪酮的功能有顯著影響，但存在個體差異。結(jié)論長時間內(nèi)服450 mg甘草提取物/kg體重對雄性小鼠有一定的生殖毒性作用。

關(guān)鍵詞〔〕甘草；生殖毒性；間質(zhì)細(xì)胞

中圖分類號〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(GJJ1053)；井岡山大學(xué)博士科研啟動金項目(JZB11018)

1吉安市食品藥品檢驗所

第一作者：孫新明(1968-)，男，博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合與基礎(chǔ)研究。

不孕不育癥是全球性復(fù)雜的醫(yī)學(xué)和社會學(xué)問題之一。隨著工業(yè)的日益發(fā)達(dá)及對環(huán)境污染控制的相對不足和臨床藥物濫用對男性生殖健康日益嚴(yán)重的影響，男性因素所引發(fā)的不育不孕癥發(fā)生率越來越高而逐漸引起人們的重視〔1～3〕。長期以來，甘草等植物中草藥及其復(fù)方常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥得以廣泛應(yīng)用，甘草的主要化學(xué)成分是甘草甜素、甘草次酸。而中藥藥理學(xué)認(rèn)為，大劑量的甘草甜素有雌激素樣作用,而甘草次酸具有抑制雄性小鼠生殖腺產(chǎn)生睪酮的作用〔4〕，且近代藥理研究也發(fā)現(xiàn)，不少臨床常用的中藥如甘草、補骨脂等可促進(jìn)雌性動物乳腺發(fā)育和子宮明顯增重及血清雌激素水平升高〔5〕，但其雌激素樣作用是否與環(huán)境雌激素一樣具有男性生殖毒性作用？特別是甘草對男性生殖系統(tǒng)的毒性作用目前未見系統(tǒng)、詳細(xì)的研究報道。鑒于此，本研究從中藥體內(nèi)給藥及研究甘草對睪丸結(jié)構(gòu)及功能的影響，同時對分離的睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外給藥研究甘草制劑對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長及其分泌睪酮功能的影響，以了解含雌激素樣作用的中草藥對睪丸的生殖毒性作用。

1材料與方法

1.1 實驗動物和材料清潔級BABL/c雄鼠20只(購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司)；市售藥用甘草采用超聲提取法和樹脂吸附技術(shù)自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/ml)后，灌服液用前以蒸餾水稀釋成給藥所需藥物濃度后經(jīng)高壓滅菌后冷卻備用，培養(yǎng)用液以PBS溶液配制成10 mg/ml藥物濃度，過濾除菌，置冰箱冷藏備用；

1.2 主要試劑DMEM、DMEM/F12、小牛血清、苔盼藍(lán)購于Gibco公司；膠原酶、透明質(zhì)酸酶、percoll分離液、HEPEs購于Sigma公司；胰蛋白酶購于Amresco公司；HE染色液、PBS、D-hanks液培養(yǎng)基均為自制試劑；其他常規(guī)普通試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 體內(nèi)給藥劑量的確定及實驗分組通過預(yù)實驗確定甘草浸膏藥物高、低劑量組。預(yù)實驗中低劑量組劑量為人類臨床實際接觸水平(臨床成人每日常用給藥量為含12 mg甘草酸的甘草劑量，換算成甘草為45 mg/kg體重)；首次設(shè)置的高劑量組劑量為低劑量組的30倍，結(jié)果若能使親代動物出現(xiàn)輕度中毒，但不出現(xiàn)死亡或死亡率不超過10%〔6〕，則此劑量確定為高劑量組給藥劑量，否則要調(diào)節(jié)給藥劑量，直至達(dá)到要求。

確定高、低給藥劑量后，將體內(nèi)實驗分為成年雄性鼠給藥組和妊娠期母鼠給藥組。其中雄性鼠給藥組的個體為60只8周齡雄性鼠，在實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d后,隨機(jī)分為高、低劑量組和對照組各20只，各組灌胃等量溶液(給藥組每只小鼠給予相應(yīng)高、低劑量各0.4 ml藥液，給對照組小鼠每只0.4 ml生理鹽水)，每天1次，連續(xù)給藥60 d。妊娠期母鼠給藥組同樣分為高、低劑量組和對照組各20只，所有配種母鼠挑選發(fā)情雌鼠(陰門潮濕、發(fā)紅的性成熟個體)，按公母比例1∶1放入公鼠籠內(nèi)合籠交配,于次日凌晨7～8點檢查白色陰道栓者為懷孕鼠，該天記為懷孕第1天，于妊娠 第6天開始直至產(chǎn)仔后斷奶期間給妊娠母鼠灌胃給藥。在每組給藥妊娠母鼠所產(chǎn)雄性仔鼠中隨機(jī)選取20只，正常飼養(yǎng)至性成熟后與給藥雄性鼠同樣與成年雌鼠交配，并檢測以下指標(biāo)。

1.3.1 性行為及配種能力的觀察每只實驗雄鼠按上述方法與發(fā)情雌鼠合籠交配,觀察雄性小鼠的性行為(主要是追逐與爬跨母鼠)。于次日凌晨7～8點檢查有白色陰道栓者為懷孕鼠,該天記為懷孕第1天，飼養(yǎng)懷孕鼠至產(chǎn)仔，記錄產(chǎn)仔數(shù)及雌雄比例。所有雄鼠交配結(jié)束后進(jìn)行以下測定。

1.3.2 血漿睪酮濃度測定末次給藥24 h后，將全部小鼠斷頭取血，加入EDTA混合后離心分離血漿，用放射免疫法測定血漿睪酮濃度。

1.3.3 睪丸重量的測量取各組小鼠雙側(cè)睪丸，用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙濾干，電子天平稱重。計算平均睪丸重量，并計算睪丸指數(shù)〔7〕,同時觀察記錄睪丸形態(tài)的變化。

1.3.4 睪丸組織形態(tài)的觀察取各組小鼠左側(cè)睪丸組織，用Bouin固定液固定后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察生精小管形態(tài)和精子發(fā)生狀態(tài),包括曲細(xì)精管形態(tài)及密度、各級生精細(xì)胞層次、睪丸間質(zhì)數(shù)量及其中血管的變化。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗。

2結(jié)果

2.1 體內(nèi)給藥劑量確定以人類實際接觸的臨床劑量作為低劑量組給藥劑量，預(yù)實驗時以低劑量組劑量的30倍作為高劑量組劑量，即1 350 mg/kg作為高劑量組給藥劑量，結(jié)果高劑量組實驗動物在灌胃給藥20 d內(nèi)死亡率達(dá)80%，而低劑量組無一死亡。降低高劑量組劑量至低劑量組的20倍，結(jié)果死亡率也超過10%，隨即降低高劑量組劑量至低劑量組的10倍，給藥1個月后死亡率低于10%，故高劑量組給藥劑量確定為450 mg/kg。

2.2 甘草對成年雄性個體生殖功能的影響

2.2.1 甘草對成年雄性個體性行為和配種能力的影響實驗雄鼠灌胃給藥到期后與發(fā)情期雌鼠合籠交配,并觀察雄性小鼠的性行為。在對照組雄鼠幾乎所有個體均表現(xiàn)出較頻繁的追逐與爬跨母鼠；高劑量組每次灌胃給藥后都表現(xiàn)有不同程度的精神萎靡等癥狀，因此對母鼠普遍表現(xiàn)為性冷淡；而低劑量組多數(shù)在灌胃給藥后30 min～1 h也表現(xiàn)出追逐與爬跨母鼠。次日凌晨檢查與雄鼠合籠的母鼠陰道栓檢出率及所產(chǎn)仔雌雄比見表1。與高、低劑量的雄鼠配種的母鼠妊娠率(母鼠陰道栓檢出率)及每組總產(chǎn)仔數(shù)明顯低于對照組(P<0.05)。

表1　成年雄性個體灌胃給藥后配種結(jié)果( n=20)

與對照組比較：1)P<0.05

2.2.2 甘草對雄鼠分泌睪酮功能的影響高劑量組雄性鼠的血漿睪酮濃度〔(2.025±1.97)ng/ml〕比低劑量組〔(3.865±0.39)ng/ml〕和對照組〔(4.012±0.25)ng/ml〕要低,但差異不顯著(P>0.05)。而從高劑量組每只小鼠的血漿睪酮濃度看，高劑量甘草制劑對雄性小鼠睪丸分泌睪酮功能的影響具有較大的個體差異，其中有的小鼠血漿睪酮濃度僅0.049 ng/ml，而有的小鼠血漿睪酮濃度與對照組小鼠睪酮水平相近。

2.2.3 甘草對雄鼠睪丸外觀形態(tài)及重量的影響各組雄鼠睪丸外觀形態(tài)及質(zhì)地?zé)o明顯異常。表2顯示，雄鼠的睪丸重量及睪丸指數(shù)在對照組、低劑量組、高劑量組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2　各組雄性個體灌胃給藥后睪丸指數(shù)比較 ± s, n=20)

2.2.4 甘草對雄鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響實驗后對小鼠左側(cè)睪丸進(jìn)行組織切片，HE染色后觀察，結(jié)果顯示：對照組雄鼠睪丸在光鏡下,曲細(xì)精管的生精細(xì)胞層數(shù)多，各級生精上皮細(xì)胞層次明顯，排列緊密，管腔內(nèi)充滿精子，精小管外基膜薄，間質(zhì)細(xì)胞成群分布。低劑量組與對照組的睪丸組織結(jié)構(gòu)無明顯差別。但在高劑量組，約一半雄鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出曲細(xì)精管明顯退化、萎縮，睪丸曲細(xì)精管間隙明顯增大，精曲小管之間的結(jié)締組織增多，但結(jié)締組織中間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量卻明顯減少；但各級生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)無明顯變化，且分層明顯，見圖1。

2.3 母鼠妊娠期內(nèi)服甘草對F1代雄性個體生殖能力的影響

圖1　各組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

2.3.1 甘草對F1代雄鼠配種能力的影響各組妊娠母鼠所產(chǎn)F1代雄鼠與雌鼠的配種能力、配種后母鼠妊娠率(母鼠陰道栓檢出率)、平均窩產(chǎn)仔數(shù)及所產(chǎn)仔雌雄比均無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3　各組F1代雄鼠的交配結(jié)果( n=20)

2.3.2 給藥妊娠母鼠F1代雄性小鼠血漿睪酮濃度的測定各組F1代雄鼠的血漿睪酮濃度在高〔(3.798±0.18)ng/ml〕、低劑量組〔(3.965±0.15)ng/ml〕和對照組〔(3.942±0.28)ng/ml〕間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.3 妊娠期內(nèi)服甘草對F1代雄鼠睪丸外觀形態(tài)及重量的影響各組雄鼠睪丸外觀形態(tài)及質(zhì)地均無明顯異常(P>0.05)。對孕期母鼠給藥后所產(chǎn)雄鼠成年后的睪丸重量及睪丸指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。見表4。

2.3.4 妊娠期內(nèi)服甘草對F1代雄鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響對孕期母鼠給藥后所產(chǎn)小鼠成年后的睪丸組織切片與一般正常小鼠睪丸組織切片相似無異常。見圖2。

表4　各組F1代雄性個體睪丸指數(shù)比較

圖2　各組F1代睪丸組織結(jié)構(gòu)觀察(HE，×200)

3討論

植物雌激素是一類具有類似動物雌激素生物活性的植物成分，主要有異黃酮類和香豆素類，廣泛分布于自然界植物中，屬于環(huán)境雌激素之一，其生理活性多種多樣，是天然藥物的重要成分。植物雌激素的生物活性因其種類、劑量、營養(yǎng)途徑及作用對象的不同而有較大的變化。其作用類似于雌二醇，但并不完全一樣，其生物效應(yīng)約相當(dāng)于雌二醇的10-3～10-5，具有較弱的雌激素和抗雌激素活性的雙重作用，即在內(nèi)源性雌激素水平較低時，它可與雌激素受體相結(jié)合，表現(xiàn)出雌激素激動劑的作用，而在內(nèi)源性雌激素水平較高時，它則競爭結(jié)合雌激素受體，表現(xiàn)出抗雌激素作用〔8〕。有關(guān)植物雌激素對雄性動物生殖功能的影響，有研究報道認(rèn)為，給雄性動物喂飼含異黃酮類雌激素的植物可促進(jìn)睪丸增重和血清睪酮含量，并促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管明顯增大，初級精母細(xì)胞形成提前，即具有促進(jìn)雄性動物生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用〔7〕，因而表現(xiàn)出與環(huán)境雌激素對雄性個體完全不一樣的作用〔9〕。但中草藥雌激素樣作用對睪丸毒性的研究報道并不多。

甘草具有補脾益氣、清熱解毒、緩急、止痛等功效。常用于脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸短、咳嗽痰多、脘脹、四肢攣急、疼痛、癰腫瘡、緩解藥物毒性等。中醫(yī)界自古有 “十方九草”之說〔10 〕。本研究結(jié)果提示臨床劑量的甘草對雄性個體生殖功能無明顯毒性作用，但長時間內(nèi)服臨床劑量10倍以上的甘草劑量會引起雄性個體一定程度的生殖毒性。

關(guān)于植物雌激素對雄性生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響，朱鋒榮等〔11〕的研究認(rèn)為，在體外給予低濃度植物雌激素(0.1 μmol/L染料木素)時可顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮,但當(dāng)植物雌激素濃度大于5 μmol/L時,卻顯著抑制Leydig細(xì)胞的睪酮分泌。而苦參可使精子瞬間失活的最低有效濃度為 0.85～3.15 g/L,形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)苦參堿對精子有致死作用,而蘆薈對雄性鼠性腺、精液有一定的影響,使雌性小鼠的妊娠率降低,畸胎率升高〔12〕。本實驗之所以選用睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)來檢測甘草對生殖細(xì)胞的體外毒性，是因為該細(xì)胞作為合成和分泌雄激素(睪酮)的主要場所，其生存狀態(tài)及分泌睪酮的功能活動可在很大程度上影響、甚或體現(xiàn)睪丸的生殖活動〔13〕。此外，本研究中對分離到的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后HE染色鏡檢，形態(tài)變化與劉玉志等〔14〕報道的相同，因此在本實驗中未對相同方法分離培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。本研究結(jié)果顯示，超過10 μg/ml甘草提取物濃度對體外原代培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長和睪酮分泌均具有顯著抑制作用，且隨藥物濃度增加和培養(yǎng)時間延長，抑制作用越加明顯。

關(guān)于生殖毒性實驗分組,考慮到甘草并不是一味強毒性中草藥，其毒性實驗過程應(yīng)較為漫長，所以無論在給藥的成年雄性還是妊娠母鼠均沒有更詳細(xì)階段的實驗分組，給藥濃度也因此沒有進(jìn)一步分為高、中、低實驗組。

此外，實驗過程中還觀察到，高劑量甘草制劑無論喂服雄性鼠還是妊娠母鼠，約80%以上的個體會表現(xiàn)出明顯的免疫抑制反應(yīng)，如引起小鼠多處皮膚膿腫、潰爛，甚至全身性皮下出現(xiàn)小膿包，后致皮膚增厚。這在雄鼠，勢必會影響其生理活動，如性行為及隨后的配種能力，但對妊娠母鼠產(chǎn)仔無明顯影響，也不明顯影響妊娠母鼠所產(chǎn)F1代雄鼠的各項生理指標(biāo)。關(guān)于雌激素對機(jī)體免疫能力的影響，研究認(rèn)為，環(huán)境雌激素可改變機(jī)體免疫功能和增加自身免疫性的作用，生理濃度的雌激素可提高機(jī)體免疫力 ,劑量較大時則增加自身免疫性疾病的易感性〔15〕。有實驗顯示 ,小鼠經(jīng)雌激素處理后 ,體內(nèi) T細(xì)胞功能減退 ,而 B細(xì)胞功能亢進(jìn) ,淋巴器官中淋巴細(xì)胞減少 ,促進(jìn) B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病〔16〕。但有關(guān)甘草對機(jī)體免疫功能的影響仍需做進(jìn)一步研究。

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〔2013-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)