·基礎(chǔ)研究·

脾氣虛大鼠骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路中CaM及CaMKⅡ基因表達(dá)變化

成映霞段云燕段永強(qiáng)1，2程衛(wèi)東2楊曉軼1杜娟劉靚朱立鳴梁玉杰1安耀榮1高建德田茸

(甘肅中醫(yī)學(xué)院甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730020)

摘要〔〕目的探討脾氣虛大鼠骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路中鈣調(diào)蛋白(CaM)、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(CaMK)Ⅱ基因表達(dá)變化規(guī)律。方法受試動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、脾氣虛模型組(7 d、14 d、21 d組)，每組10只。除空白組外，其余受試動(dòng)物采用復(fù)合法(苦寒破氣法、力竭法及饑飲失常法)成功建立脾氣虛證大鼠模型后，在觀察各組大鼠一般生存狀態(tài)、脾虛證宏觀證候積分、平均每日攝食量、平均每日體重增加量和負(fù)重游泳耐力的同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)骨骼肌組織CaM信號(hào)通路中CaM、CaMKⅡ基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果與空白組比較，脾氣虛7 d、14 d、21 d組大鼠一般生存狀況較差，脾虛宏觀證候積分顯著升高(P<0.05)，平均每日攝食量、平均每日體重增加量和負(fù)重游泳耐力降低(P<0.05)，骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低，且以脾氣虛模型21 d組變化顯著(P<0.05)。結(jié)論脾氣虛大鼠骨骼肌組織CaM信號(hào)通路中CaM、CaMKⅡ基因表現(xiàn)為低表達(dá)水平。

關(guān)鍵詞〔〕脾氣虛證；鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路；鈣調(diào)蛋白；鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160420)；甘肅省自然科學(xué)基金(1010RJZA148)；甘肅省教育廳基金(1006-05)

通訊作者：段永強(qiáng)(1974-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)臨床基礎(chǔ)、脾胃病和老年病研究。

1甘肅中醫(yī)學(xué)院甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)新工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所

第一作者：成映霞(1976-)，女，副教授，碩士，主要從事中醫(yī)脾胃病和中醫(yī)基礎(chǔ)理論的教學(xué)、臨床和科研工作。

The expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency

CHENG Ying-Xia，DUAN Yun-Yan，DUAN Yong-Qiang，etal.

Gansu College of TCM，Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province，Lanzhou 730020，Gansu，China

Abstract【】ObjectiveTo research the expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency.MethodsRats were randomly divided into normal，spleen-qi deficient model groups (observed on 7 d，14 d and 21 d)，10 rats in each.The spleen-qi deficient model rats were made by rhubarb，exhaustive and hungry method; then the general condition，macroscopic spleen deficiency syndrome integral，the average food intake，daily weight gain and loading swimming endurance were evaluated，and the expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in skeletal muscle tissue were evaluated by real time fluorescent quantitative PCR.ResultsCompared with those of normal group，the general of survival was poor，macroscopic spleen deficiency syndrome integral was increased(P<0.05)，the average food intake，average daily weight gain and loading swimming endurance were decreased(P<0.05)，and relative expression of CaM，CaMKⅡ mRNA in skeletal muscle tissue were decreased in model group，this difference was obvious on spleen-qi deficient model 21 d group(P<0.05).ConclusionsThe expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA are decreased in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency.

【Key words】Spleen-qi deficiency; Calmodulin signaling pathways; Calmodulin; Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ

脾氣虛證作為中醫(yī)臨床常見(jiàn)的臟腑疾病證候之一，主要以消化道功能障礙或減弱為主的全身性生理功能減弱；同時(shí)，中醫(yī)認(rèn)為“脾主運(yùn)化”，“脾氣散精”而將水谷精微輸布全身，內(nèi)至五臟六腑、外達(dá)四肢百骸，充養(yǎng)肌體，故有“脾主身之肌肉”之論。本研究基于“脾虛”可導(dǎo)致機(jī)體神疲乏力、形體消瘦甚至肌肉萎廢不用等癥狀的病理機(jī)制，并結(jié)合具有多種生物學(xué)功能的鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(CaMK)Ⅱ信號(hào)通路，以脾氣虛證大鼠為對(duì)象，研究骨骼肌組織鈣調(diào)蛋白(CaM)、CaMKⅡ基因在脾氣虛證病程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，以期從CaMKⅡ信號(hào)通路角度揭示脾氣虛證發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物3月齡SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～190 g，甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001-0001011；實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001-0000314。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處理的相關(guān)程序遵守了中國(guó)國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(NHNRC)動(dòng)物道德準(zhǔn)則并得到了甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑中藥均購(gòu)自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司。大黃、厚樸、枳實(shí)按2∶1∶1組成，以上方藥分別常規(guī)煎煮、去渣濾出藥液加熱濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后置4℃冰箱備用，使用時(shí)稀釋至所需濃度。

β-actin、CaM、CaMKⅡ引物：寶生物工程(大連)有限公司；TRIzol 試劑(批號(hào)AK7208-1)、反轉(zhuǎn)錄及Real Time qPCR試劑盒(批號(hào)0000036802)均購(gòu)自Promega Corporation。

1.3主要儀器DF110型電子分析天平(江蘇常熟衡器工業(yè)公司)，XYJ80-2離心機(jī)(廣東塘廈駿越機(jī)電設(shè)備廠)，BIOMATE 3S核酸蛋白測(cè)定儀，S1000TM逆轉(zhuǎn)錄儀，Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，CFX96TM Optics Module PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.4分組與造模48只SPF級(jí)Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按體重從小到大編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、脾虛模型組(7 d、14 d、21 d)，每組12只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)脾氣虛證模型〔1〕：以苦寒破氣法(大黃、枳實(shí)、厚樸)、游泳力竭法及饑飽失常法三因素復(fù)合法復(fù)制脾氣虛證模型：(1)苦寒破氣法：造模組大鼠每日上午按7.5 g·kg-1·d-1大黃枳實(shí)厚樸制劑液灌胃，每日1次；(2)游泳力竭法：每日下午2：00使大鼠負(fù)重游泳，于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體重10%的保險(xiǎn)絲，放入水深50 cm、水溫20℃的水槽中游泳，并記錄大鼠游泳耐力時(shí)間，以游泳力竭(即大鼠鼻尖沒(méi)入水面10 s)為度，每日1次。(3)饑飽失常法：每日8：00給予定量飼料，20：00撤去飼料并稱量剩余量，隔日再給予定量飼料，自由飲水。造模期間，空白組大鼠每日上午按1 ml/100 g體重灌服生理鹽水，并給予抓捏刺激，每日上午、下午各1次，每次定時(shí)給予定量飼料稱量剩余量，自由飲水。

1.5脾氣虛大鼠一般生存狀況、脾虛宏觀證候評(píng)分、平均每日攝食量和平均每日體重增加量測(cè)定

1.5.1脾虛證模型宏觀證候表現(xiàn)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模型復(fù)制成功評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部藥政局頒布的《中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》〔2〕和《中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型方法學(xué)》〔3〕并結(jié)合大鼠的生物學(xué)特征擬定。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①蜷縮扎堆計(jì)1分；②瞇眼弓背、背毛無(wú)光澤計(jì)1分；③攝食量減少計(jì)1分；④體重增加緩慢或下降，同比消瘦計(jì)2分；⑤便形質(zhì)軟或溏稀計(jì)2分；⑥肛溫下降計(jì)1分；⑦游泳耐力下降計(jì)2分。

1.5.2大鼠平均每日體重增加量和攝食量的測(cè)定〔4，5〕各組大鼠于造模及治療前用精確電子秤測(cè)定初始體重，并于每日8：00給食前測(cè)定體重和所給飼料量，至次日8：00測(cè)定飼料剩余量并記錄各組大鼠取材前3 d平均每日攝食量。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)造模時(shí)分別于第7、14、21日取材并制備待檢樣本。各組大鼠于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，烏拉坦(1 g/kg)麻醉采血后斷頭處死并制備待檢標(biāo)本。骨骼肌組織的收集：受試動(dòng)物麻醉處死后，迅速將骨骼肌組織(股四頭肌)截取，其中一部分骨骼肌組織置于用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的凍存管中，-80℃冷凍保存檢測(cè)CaM、CaMKⅡ基因表達(dá)。

1.7骨骼肌CaM、CaMKⅡ基因表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取適量骨骼肌組織，用Trizol法抽提總RNA：將保存于-80℃冷凍冰箱中的各組大鼠骨骼肌組織稱取50 mg置于研缽中，加入 1 ml Trizol 研磨均勻，冰上孵育5 min 后，4℃、12 000 r/min離心5 min；移入離心管中，冰上孵育5 min 后加0.2 ml氯仿，震蕩后4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液移至新離心管，加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育10 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，震蕩后4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液后室溫下干燥，加入 50 μl DEPC 處理水溶解RNA。核酸定量分析儀測(cè)定其OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0，經(jīng)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取的RNA符合純度要求，可用于后續(xù)PCR。反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA：在0.5 ml去酶管中加入總RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μl、Random Primer 1 μl，加Nuclease-Free Water至10 μl；70℃變性5 min，然后冰上放置5 min以上；加入逆轉(zhuǎn)錄Go ScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μl，MgCl2(25 mmol/L)2 μl，PCR Nucleotide Mix(10 mmol/L)1 μl，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μl，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μl，Nuclease-Free Water至10 μl，總體積為20 μl?；靹蚺渲频姆磻?yīng)混合物，短暫離心后25℃溫浴5 min，42℃反應(yīng)60 min，再70℃ 15 min滅活處理，所得單鏈cDNA放置于-20℃?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)：從NCBI中查尋目標(biāo)基因ID及序列，由TAKARA公司〔寶生物工程(大連)有限公司〕設(shè)計(jì)、合成目標(biāo)基因引物。引物序列：β-actin正義5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，反義5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度150 bp；CaM正義5′-TCAGAACCCAACAGAGGCTGAA-3′，反義5′-GTCAAAGACTCGGAATGCCTCAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度160 bp；CaMKⅡ正義5′-GATGTGCGACCCTGGAATGA-3′，反義5′-ATGTAGGCGATGCAGGCTGAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度183 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設(shè)3復(fù)孔、6次平行實(shí)驗(yàn)，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值。反應(yīng)體系根據(jù)GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說(shuō)明書(shū)配制。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃、2 min，變性95℃、15 s，退火60℃、60 s，循環(huán)40次，終末延伸65℃、5 s。連續(xù)檢測(cè)熒光并記錄擴(kuò)增曲線，采用樣點(diǎn)擬合法分析結(jié)果得到目的基因和β-actin的Ct值。分析溶解曲線，用比較Ct值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：ΔΔCt=(測(cè)試組目的基因Ct值-測(cè)試組內(nèi)參基因Ct值)-(對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值)，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般生存情況空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏、活動(dòng)及飲食量正常、被毛濃密柔順而有光澤、糞便呈棕褐色顆粒狀。脾虛模型各組大鼠多數(shù)在第5天即開(kāi)始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯；第7天后出現(xiàn)怠動(dòng)少食、肛周污穢，甚至動(dòng)作遲緩；第14天后出現(xiàn)怠動(dòng)少食、消瘦弓背、肛周污穢，部分動(dòng)物出現(xiàn)脫肛、動(dòng)作遲緩，并逐漸出現(xiàn)體重減輕、大便稀軟呈橘黃色，而且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)上述癥狀表現(xiàn)突出；尤其在脾虛21 d組中，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠生存能力明顯下降，表現(xiàn)為怠動(dòng)少食、消瘦弓背、毛發(fā)枯槁疏散、肛周污穢，部分大鼠瞇眼蜷縮、反應(yīng)遲鈍，體重增長(zhǎng)明顯減緩。

2.2各組大鼠平均每日體重增加量和游泳耐力時(shí)間比較與空白組比較，脾氣虛7 d、14 d組大鼠體重增加量、游泳耐力時(shí)間有下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，脾氣虛21 d組大鼠體重增加量、游泳耐力時(shí)間均顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與脾氣虛7 d組比較，21 d組大鼠游泳耐力時(shí)間顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠平均每日體重增加量和

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與脾氣虛7 d組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.3各組大鼠平均每日攝食量和脾虛宏觀證候積分比較與空白組比較，脾氣虛7 d組大鼠平均每日攝食量有降低趨勢(shì)，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，脾氣虛14 d、21 d組大鼠平均每日攝食量顯著降低(P<0.05)，而且脾氣虛7 d、14 d、21 d組大鼠脾虛宏觀證候積分顯著升高(P<0.01)；與脾氣虛7 d組比較，脾虛21 d組大鼠脾虛宏觀證候積分顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠平均每日攝食量和脾虛宏觀

2.4各組大鼠骨骼肌組織CaM/CaMKⅡ基因表達(dá)比較通過(guò)熔解曲線得知，本研究的擴(kuò)增具有特異性。與空白組比較，脾氣虛7 d組大鼠骨骼肌組織CaM基因相對(duì)表達(dá)量有降低趨勢(shì)，但組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，脾氣虛14 d、21 d組大鼠骨骼肌組織CaM基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且與脾氣虛7 d組比較，21 d組大鼠骨骼肌組織CaM基因相對(duì)表達(dá)量降低更顯著(P<0.05)；而脾氣虛7 d、14 d組大鼠骨骼肌組織CaMKⅡ基因相對(duì)表達(dá)量有降低趨勢(shì)，但組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，脾氣虛21 d組大鼠骨骼肌組織CaMKⅡ基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM/CaMKⅡ基因表達(dá)的

3討論

脾虛證的病理機(jī)制主要以消化系統(tǒng)功能紊亂為主，臨床表現(xiàn)見(jiàn)面色淡白或萎黃、納呆少食、惡風(fēng)易感、腹脹腹瀉等，嚴(yán)重脾虛者則見(jiàn)神疲乏力、少氣懶言、肢體倦怠、形體消瘦等癥狀。本研究建立的模型大鼠出現(xiàn)的癥候群與《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》〔6〕和《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》〔7〕描述的大鼠生理特點(diǎn)、《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》〔8〕以及總結(jié)近10年醫(yī)學(xué)期刊文獻(xiàn)資料建立的脾虛大鼠癥狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)〔9〕的依據(jù)相吻合。結(jié)合國(guó)內(nèi)對(duì)脾虛動(dòng)物模型研究的文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為復(fù)建脾虛大鼠模型的造模持續(xù)時(shí)間以21 d為宜，這與多數(shù)學(xué)者復(fù)建脾虛證模型的持續(xù)時(shí)間相一致。

因?yàn)榇笫笃骄咳諗z食量可以反映其攝食行為和基礎(chǔ)代謝，而平均每日體重增加量可以反映機(jī)體物質(zhì)代謝與合成以及生長(zhǎng)發(fā)育狀況〔10〕；同時(shí)機(jī)體疲勞狀態(tài)或不耐疲勞的客觀生理表現(xiàn)主要是運(yùn)動(dòng)耐力的下降，而負(fù)重游泳力竭時(shí)間是反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的重要指標(biāo)〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，脾氣虛大鼠逐漸出現(xiàn)平均每日攝食量下降、平均體重增加緩慢、抗疲勞耐力和基礎(chǔ)代謝功能下降。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論認(rèn)為，在CaM細(xì)胞信號(hào)通路中，CaM作為細(xì)胞內(nèi)鈣離子受體可與游離鈣離子可逆性結(jié)合，并激活下CaM依賴的蛋白激酶——CaMKⅡ發(fā)揮作用。CaM牽連許多細(xì)胞內(nèi)生理過(guò)程〔12〕，包括調(diào)節(jié)肌肉收縮和舒張(包括平滑肌和骨骼肌、心肌)；調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、突觸傳遞、軸漿運(yùn)輸；參與刺激分泌耦聯(lián)及調(diào)節(jié)糖代謝等，說(shuō)明CaM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其信息分子在機(jī)體多系統(tǒng)生理功能的正常發(fā)揮中具有重要生物學(xué)作用。而且中醫(yī)認(rèn)為“脾胃為氣血生化之源”、“脾在體合肌肉而主四肢”，即通過(guò)脾胃運(yùn)化水谷精微化生氣血而濡養(yǎng)四肢百骸和肌肉組織；中醫(yī)實(shí)際臨床中的臟腑病癥亦表現(xiàn)出脾虛可導(dǎo)致神疲乏力、形體消瘦甚至肌肉萎廢不用的病癥。故本研究通過(guò)觀察脾虛證病程中骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，以期從CaMKⅡ信號(hào)通路角度揭示脾氣虛證發(fā)生的深層次病理機(jī)制。本研究結(jié)果表明脾氣虛大鼠骨骼肌組織CaM信號(hào)通路中CaM、CaMKⅡ基因?yàn)榈退奖磉_(dá)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-01-11修回〕

(編輯袁左鳴)