瑞舒伐他汀對(duì)大鼠心肌梗死后細(xì)胞凋亡及對(duì)線粒體融合素2表達(dá)的影響

周煒陳玲周逸陳曼華

(武漢市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢430014)

摘要〔〕目的研究不同劑量瑞舒伐他汀對(duì)大鼠心肌梗死后細(xì)胞凋亡及線粒體融合素2蛋白表達(dá)的影響。 方法選取雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)，心肌梗死組(MI)，瑞舒伐他汀1組(Statin 1)和瑞舒伐他汀2組(Statin 2)，每組12只。Statin 1組術(shù)前7 d開始每日給予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，Statin 2組藥物劑量為每日20 mg/kg，MI組以蒸餾水灌胃，隨后制備心肌梗死模型。術(shù)后24 h采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫印跡法檢測(cè)磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)線粒體融合素2的表達(dá)。 結(jié)果與Sham組相比，MI組及Statin 1組、2組心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，p-Akt表達(dá)顯著下降，線粒體融合素2表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與MI組相比，Statin 1組、2組心肌細(xì)胞凋亡和線粒體融合素2表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而p-Akt表達(dá)顯著增高(P<0.05)，且Statin 2組較1組變化更顯著(P<0.05)。結(jié)論瑞舒伐他汀可抑制大鼠心肌梗死后的細(xì)胞凋亡，其作用可能與抑制線粒體融合素2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕瑞舒伐他?。恍募」Ｋ?；凋亡；線粒體融合素2基因

中圖分類號(hào)〔〕R541.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(WX12B03)；武漢市科技局關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)計(jì)劃(2013060602010256)

通訊作者：陳曼華(1962-)，女，主任醫(yī)師，主要從事冠心病的介入治療研究。

第一作者：周煒(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及基因治療研究。

心肌細(xì)胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因〔1〕。目前發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過原癌基因Ras法尼基化的相關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路激活，發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、抗動(dòng)脈粥樣硬化、心肌保護(hù)等調(diào)脂外作用〔2,3〕。線粒體融合素2(Mfn2)是利用差異顯示法從自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)克隆獲得的基因，其表達(dá)產(chǎn)物可負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔4〕。目前關(guān)于他汀類藥物對(duì)Mfn2的調(diào)節(jié)作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠急性心肌梗死模型，觀察瑞舒伐他汀對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及Mfn2表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明其抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑小動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-300S型，成都泰盟科技有限公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，高清晰度數(shù)字視屏顯微鏡(日本Nikon公司)；凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑盒(德國Roche公司)；Mfn2抗體(英國Abcam公司)，p-Akt抗體、Akt抗體、α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Cell signaling公司)。免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(武漢博士德公司)；瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司)。其他的試劑采用國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)分組選取健康雄性SD大鼠48只，體重(250±30)g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham)；心肌梗死組(MI)；瑞舒伐他汀1組(Statin 1)；瑞舒伐他汀2組(Statin 2)，共4組，每組12只。Statin 1組術(shù)前7 d開始每日給予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，Statin 2組藥物劑量為20 mg/kg，劑量的選擇參考文獻(xiàn)〔5〕。Sham組及MI組予等量蒸餾水灌胃。

1.3建立大鼠MI模型參照文獻(xiàn)進(jìn)行〔1〕。3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，小動(dòng)物呼吸機(jī)鼻面罩輔助通氣。調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)：潮氣量6~8 ml/kg，呼吸頻率70~80次/min，吸呼比1∶2。開胸后分離胸膜、心包，在左心耳下緣、肺動(dòng)脈圓錐水平結(jié)扎左前降支。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為：①心電圖標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)ST段呈弓背向上型抬高，②結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端心肌出現(xiàn)蒼白。假手術(shù)組開胸后于左前降支下穿線，不結(jié)扎。各組存活至術(shù)后24 h的動(dòng)物數(shù)量分別為Sham組(12只)，MI組(9只)，Statin 1組(10只)，Statin 2組(10只)。處死大鼠后取心臟標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋后切片。

1.4缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡按試劑盒操作說明染色，以細(xì)胞核染成棕黃色為陽性，每張切片在梗死邊緣區(qū)域(Sham組在左室前壁)隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，記錄陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，AI(%)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%，每張切片取5個(gè)視野求均值。

1.5免疫組化法檢測(cè)Mfn2蛋白表達(dá)按試劑盒說明操作檢測(cè)Mfn2蛋白表達(dá)。每張切片在梗死邊緣區(qū)域(Sham組在左室前壁)隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，虛擬顯微鏡拍攝圖像，使用Image pro-Plus圖像分析軟件測(cè)定Mfn2蛋白表達(dá)平均光密度值(MOD)。

1.6免疫印跡法檢測(cè)p-Akt的表達(dá)提取組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜在一抗(抗β-actin、抗p-Akt、抗Akt)中4℃孵育過夜。緩沖液洗脫后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中室溫孵育2 h后進(jìn)行檢測(cè)。Quantity One軟件測(cè)定條帶灰度值，進(jìn)行半定量分析。

2結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞凋亡的分布經(jīng)TUNEL染色及蘇木素復(fù)染后凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。Sham組心肌細(xì)胞未見明顯凋亡；與MI組比較，瑞舒伐他汀1組、2組AI均顯著下降(P<0.05)，且瑞舒伐他汀2組較1組AI降低更顯著(P<0.05)，見圖1和表1。

2.2各組心肌組織p-Akt的表達(dá)及灰度分析免疫印跡法顯示，與Sham組比較，MI組及Statin1組、2組心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；與MI組比較，Statin1組、2組p-Akt表達(dá)顯著增加(P<0.05)，且Statin2組較1組表達(dá)更高(P<0.05)，見圖2和表1。

2.3各組心肌組織Mfn2蛋白的表達(dá)及光密度分析Sham組未見明顯梗死區(qū)域，Mfn2蛋白少量表達(dá)；與Sham組比較，MI組及Statin1組、2組在心肌梗死邊緣區(qū)域Mfn2蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；與MI組比較，Statin1組、2組Mfn2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且Statin2組較1組表達(dá)更低(P<0.05)，見圖3和表1。

圖1　各組TUNEL染色結(jié)果(×400)

組別nAIp-Akt灰度相對(duì)比值Mfn2光密度值Sham組120.00±0.0082.35±5.188.14±1.34MI組961.38±6.341)9.36±0.171)49.52±3.291)Statin1組1037.25±3.571)2)17.82±1.371)2)33.61±2.071)2)Statin2組1024.46±3.131)2)3)25.43±2.561)2)3)24.18±1.931)2)3)

與Sham組比較：1)P<0.01，與MI組比較：2)P<0.05，與Statin 1組比較：3)P<0.05

A.Sham組；B.MI組；C.Statin 1組；D.Statin 2組 圖2　各組免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果

圖3　各組免疫組化染色結(jié)果(DAB，×200)

3討論

心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌梗死早期細(xì)胞丟失的重要形式，并參與慢性心力衰竭的病理生理過程。急性心肌梗死發(fā)生時(shí)，缺血、缺氧以及活性氧(ROS)產(chǎn)生增加等多種因素激活促凋亡基因，通過調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。其中，Ras-PI3K/Akt信號(hào)通路是促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵路徑〔6〕。因此，通過藥物或基因治療干預(yù)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞凋亡，有可能成為防治心肌梗死的有效手段。

他汀類藥物是目前臨床應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥物，其具有多重調(diào)脂以外的作用。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物通過抑制甲羥戊酸合成，使其下游的焦磷酸法尼酯和焦磷酸牛兒基牛兒酯減少，阻礙小三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白R(shí)as、Rho、Rac等異戊二烯化，影響Ras-PI3K/Akt及絲裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)和過氧化物酶增殖物激活受體的活性，增加一氧化氮水平，減少ROS產(chǎn)生，因此具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化應(yīng)激及抗炎、抗心肌肥厚等調(diào)脂外作用〔2,3,7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前7 d開始每日給予瑞舒伐他汀可顯著抑制大鼠急性心肌梗死后的細(xì)胞凋亡，且具有一定的劑量依賴性。

Mfn2是一種線粒體外膜蛋白，廣泛分布于人體的心、腎、腦、肺、肝等不同組織中，尤以心臟和腎最為豐富，對(duì)線粒體融合、線粒體形態(tài)及功能的調(diào)節(jié)有重要作用〔4〕。Mfn2也是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中一個(gè)新的調(diào)控點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。該基因是原癌基因Ras的直接負(fù)調(diào)控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-PI3K/Akt信號(hào)通路，顯著抑制Akt的磷酸化水平，進(jìn)而減少Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Bax蛋白表達(dá)，通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用與線粒體融合無關(guān)〔8,9〕。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡時(shí)Mfn2表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)Mfn2通過上述通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)生急性心肌梗死后，局部組織Mfn2表達(dá)顯著增高，p-Akt表達(dá)顯著降低，表明Akt磷酸化受到抑制，提示缺血缺氧損傷激活了Mfn2的表達(dá)，從而促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡增加。而瑞舒伐他汀干預(yù)則可顯著下調(diào)Mfn2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Akt磷酸化，抑制心肌細(xì)胞凋亡，作用呈一定的劑量依賴性。

本文研究結(jié)果顯示，Mfn2基因可能是大鼠心肌梗死過程中一個(gè)重要的促凋亡基因，參與瑞舒伐他汀抑制心肌梗死后細(xì)胞凋亡的過程，也是瑞舒伐他汀發(fā)揮其心肌保護(hù)作用的一個(gè)重要靶基因，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-12-05修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)