李銀英，劉　宇，張振中

(1. 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院西藥學(xué)部，河南 鄭州 450014；2. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

高效液相色譜法測(cè)定4種腫瘤細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇含量

李銀英1，劉宇1，張振中2

(1. 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院西藥學(xué)部，河南 鄭州 450014；2. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

[摘要]目的建立腫瘤細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇含量的測(cè)定方法，并測(cè)定不同時(shí)間、不同細(xì)胞系對(duì)2-甲氧基雌二醇的吸收情況。方法給予腫瘤細(xì)胞含有2-甲氧基雌二醇的培養(yǎng)基，固定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，細(xì)胞破碎液進(jìn)行液-液萃取，采用反相高效液相色譜法測(cè)定2-甲氧基雌二醇含量。結(jié)果所選擇的4種腫瘤細(xì)胞系最高吸收值均在2 h，不同細(xì)胞系對(duì)藥物的吸收量略有差別。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，適合用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇含量的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]2-甲氧基雌二醇；腫瘤細(xì)胞；吸收；高效液相色譜法

2-甲氧基雌二醇是17β-雌二醇的內(nèi)原性代謝產(chǎn)物，但其卻不與雌激素受體結(jié)合。近幾年研究[1]發(fā)現(xiàn)2-甲氧基雌二醇具有良好的抗腫瘤活性，能夠在無(wú)臨床毒副反應(yīng)的劑量?jī)?nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外，雖然2-甲氧基雌二醇已經(jīng)進(jìn)入到乳腺癌、前列腺癌等實(shí)體瘤的臨床Ⅰ、Ⅱ期研究，但臨床治療效果并不令人滿意，主要是因?yàn)槠湓诎胁课换蚴茄獫{中不能持續(xù)維持有效濃度[2-4]。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)2-甲氧基雌二醇及其制劑的研究主要集中在抗腫瘤機(jī)制的研究[5]，尚未見(jiàn)有關(guān)其細(xì)胞藥物吸收，藥物含量方面的研究報(bào)道，因而我們針對(duì)該方面進(jìn)行初步研究。

1材料與方法

1.1儀器AgilentlZoo/1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，Agiteni熒光(美國(guó)Agilent公司)，AgilentlZoo化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司)，MD200-2型氮?dú)獯祪x(杭州奧盛儀器有限公司)，JY92-11超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DJ-200J電子天平(ATAY公司)，AB135-S分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，分析柱phenomenex luna 5u C18(2)(250 nm×4.60 nm)等。

1.2藥品與試劑2-甲氧基雌二醇對(duì)照品(鄭州大學(xué)藥學(xué)院自制，純度99.1%，批號(hào)：20091105)，甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，色譜純)，其他試劑均符合常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3細(xì)胞系前列腺癌PC-3細(xì)胞系，肝癌HEPG-2細(xì)胞系，胃癌SGC-7901細(xì)胞系，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。

1.4試劑的配制2-甲氧基雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取1 mg 2-甲氧基雌二醇于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇：水(75:25)混合溶劑定容搖勻，即得100 μg·mL-1的2-甲氧基雌二醇儲(chǔ)備液，再用甲醇水(7525)的混合溶劑倍比稀釋成濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

質(zhì)控樣品2-甲氧基雌二醇溶液的配制：用標(biāo)準(zhǔn)曲線中高、中、低3種濃度中的每2個(gè)濃度等體積混合可得37.5、9.375、2.343 75 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

細(xì)胞用2-甲氧基雌二醇溶液的配制：稱取2-甲氧基雌二醇，用DMSO溶解成10 mg·mL-1溶液，用于細(xì)胞時(shí)，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成4.5 μg·mL-1的所需濃度。

1.5方法

1.5.1細(xì)胞破碎液制備細(xì)胞用含有胎牛血清(體積分?jǐn)?shù)10%)、雙抗(1%)的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，相同量傳代于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞密度達(dá)70% ～ 80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入含2-甲氧基雌二醇4.5 μg·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基，分別于0.5、1、2、4、6 h定量收集細(xì)胞，并用PBS溶液洗滌2次，再用1 mL的PBS懸浮細(xì)胞使之成為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)移于5 mL EP管中；收集的細(xì)胞懸液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行破碎(工作6 s，間歇8 s，200 W超聲25次)。

1.5.2樣品處理向細(xì)胞破碎液中加入提取試劑乙酸乙酯3 mL渦旋5 min；10 000 rpm離心10 min，取上層有機(jī)相于45 ℃下空氣吹開(kāi)，殘留物于適量的甲醇：水(75:25)中渦旋溶解，10 000 rpm離心10 min后，吸取上層澄清液20 μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.5.3色譜條件色譜柱：phenomenex luna 5u C18(2)(250 nm×4.60 nm)；流動(dòng)相：甲醇水(7525)；流速：0.75 μL·min-1；激發(fā)波長(zhǎng)：288 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用計(jì)量資料用±s表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1專屬性在所選擇的色譜條件下，細(xì)胞代謝物等對(duì)2-甲氧基雌二醇的含量測(cè)定基本無(wú)干擾；2-甲氧基雌二醇的出峰時(shí)間約為9.4 min左右，分離效果見(jiàn)圖1。

圖1　2-甲氧基雌二醇色譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限精密量取不同濃度的2-甲氧基雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，45 ℃空氣揮盡溶媒，加入1 mL空白細(xì)胞破碎液，配制成15.625、31.25、62.5、125、250、500 ng·mL-1溶液，按前述方法進(jìn)行處理，以2-甲氧基雌二醇峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得曲線的回歸方程為：A=1.230 1C-13.973(r2=0．999 1)表明在15.625～500 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好，方法定量下限約是15 ng·mL-1。

2.3準(zhǔn)確度與精密度精密量取不同濃度的2-甲氧基雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，45 ℃空氣揮盡溶媒，加入細(xì)胞破碎液1 mL，準(zhǔn)確配制低、中、高3個(gè)濃度分別為23..437 5、93.75、375 ng·mL-1的質(zhì)量控制樣品各5份，連續(xù)配制、測(cè)定3 d，用以考查準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度及日間精密度。見(jiàn)表1。

表1　準(zhǔn)確度與精密度

2.4提取回收率按照前述方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)量控制樣品；另取10 μL與質(zhì)量控制樣品濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)相，即甲醇水(7525)分別稀釋至1 mL。同法20 μL進(jìn)樣測(cè)定。用質(zhì)量控制測(cè)得的峰面積與未經(jīng)提取的相同濃度溶液測(cè)得的峰面積作比，用以考查該方法的提取回收率。結(jié)果3種濃度下2-甲氧基雌二醇的提取回收率分別是(84.345 0±5.889 2)%、(88.147 0±2.368 7)%、(92.552 7±2.597 4)%。根據(jù)提取回收率70%是一般認(rèn)為有較好的提取回收率，而80%～90%則被大多數(shù)人認(rèn)為是一個(gè)可接受的限度[6]；可知本方法的提取回收率是可接受的。

2.5穩(wěn)定性按前述方法制備3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品，吹干后密封于-20 ℃冰箱保存3 d，再?gòu)?fù)溶，20 μL進(jìn)樣測(cè)定；進(jìn)樣當(dāng)天同法配制質(zhì)量控制樣品，按前述方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線并同法測(cè)定。將2種質(zhì)量控制樣品測(cè)定值進(jìn)行比較。見(jiàn)表2。

表2　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：由于凍存質(zhì)量控制樣品測(cè)定值在新配置質(zhì)量控制樣品測(cè)定值5%范圍內(nèi)認(rèn)為有較好的穩(wěn)定性[6]，提示該測(cè)定值符合要求

2.6方法學(xué)評(píng)價(jià)及藥物含量測(cè)定結(jié)果分析方法評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該方法有較好的專屬性，準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率、穩(wěn)定性均能達(dá)到分析要求，說(shuō)明該方法用于細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇含量測(cè)定是可行的。

采用該方法對(duì)4種不同細(xì)胞，不同時(shí)間藥物含量進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)4種不同腫瘤細(xì)胞加入同濃度2-甲氧基雌二醇原料藥，均在2 h時(shí)出現(xiàn)最大吸收，且總體上SGC-7901胃癌細(xì)胞吸收最好，其次依次為PC-3前列腺癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞、HEPG肝癌細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2　不同腫瘤細(xì)胞系不同藥物作用時(shí)間2-甲氧基雌二醇含量

3討論

雖然國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)[7-9]建立了人體血漿中2-甲氧基雌二醇含量的測(cè)定方法，但是對(duì)細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇的含量的測(cè)定還鮮有報(bào)道。在此我們建立了一種簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇含量的測(cè)定方法，該方法具有良好準(zhǔn)確度、精密度及大多數(shù)人認(rèn)可的提取回收率，并且有良好的穩(wěn)定性。因而該方法可用于細(xì)胞內(nèi)2-甲氧基雌二醇含量測(cè)定。并可以結(jié)合其他方法結(jié)合近一步說(shuō)明2-甲氧基雌二醇及其制劑的作用機(jī)制。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.004

[中圖分類號(hào)]R979.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5412(2015)05-0380-04

(收稿日期：2015-03-10)

High Performance Liquid Chromatography in the
Detection of 2-methoxyestradiol in Different Tumor Cell Lines

Li Yinying1,Liu Yu1,Zhang Zhenzhong2

(1.WesternMedicineDivision,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China;

2.DepartmentofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for determination the 2 - methoxyestradiol in cells, and to measure the absorption of 2-methoxyestradiol during different times, in different cell lines.MethodsThe medium containing 2-methoxyestradiol were given into cells, the cells were collected at fixed times, cell lysate was used to liquid-liquid extraction. Reversed-phase high performance liquid chromatography method was used to determine the contention of 2-methoxyestradiol.ResultsHighest absorption value of the four selected cell lines was 2 h, the drug uptake in different cell lines was slightly different.ConclusionThe method is accurate, simple operation, high sensitivity, suitable for the determination of 2-methoxyestradiol contention in tumor cell lines.

[Key words]2-methoxyestradiol; tumor cells; absorption; high performance liquid chromatography