摘要：通過(guò)對(duì)前處理過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行單因素不同水平比較，選擇出同相萃取柱、濃縮方式、氮?dú)饬髁俊⑺囟?、質(zhì)譜參數(shù)等因素的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案，建立一種簡(jiǎn)便省時(shí)及回收效果最佳的前處理流程。采用同相萃取液相色譜一電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法（HPLCIESI-MS）檢測(cè)微囊藻毒素-LR（MC-LR），選用0.2%甲酸甲醇溶液-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫、選用HLB小柱、普通氮吹儀濃縮（氮?dú)饬髁?.5L/min、水浴溫度38qC）平均回收率為89.3%。質(zhì)譜優(yōu)化結(jié)果表明：當(dāng)定量離子質(zhì)荷比995.8>135錐孔電壓49，碰撞能量54；995.8>375.1錐孔電壓49，碰撞能量50，MCYST-LR靈敏度高且響應(yīng)值最大。所建立優(yōu)化的前處理、檢測(cè)方法，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、回收率高、分離效果更好的優(yōu)點(diǎn)，可用于分析水體中痕量MC YST-LR。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素-LR；電噴霧；質(zhì)譜；前處理；優(yōu)化

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（2015） 02-0042-04

引言

藍(lán)藻水華污染所帶來(lái)的主要危害是在有毒藍(lán)藻細(xì)胞破裂后向水體中釋放多種不同類型的藻毒素，世界上25%～70%的藍(lán)藻水華污染可產(chǎn)生藻毒素；在已發(fā)現(xiàn)的各種不同藻毒素中，微囊藻毒素（mlcro-cyslin，MC）是一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類。另?yè)?jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飲用水中MC的存在與人群中原發(fā)性肝癌和大腸癌的發(fā)病率有很大的相關(guān)性。MC是一組環(huán)狀七肽，分子量為1000左右，由于多肽組成中氨基酸種類的變化，導(dǎo)致了該類毒素的多樣性，目前已鑒定的異構(gòu)體有60多種，其命名方式為MC-XZ，MC-LR表示其2，4位分別為亮氨酸（leuc，ine，L）、精氨酸（arginine，R）。

微囊藻毒素在環(huán)境水中含量很低，檢測(cè)干擾大。其檢測(cè)手段主要有傳統(tǒng)的小鼠腹腔注射生物分析法，酶聯(lián)免疫法，蛋門磷酸酶抑制法等生化分析方法，以及帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜法；國(guó)外常利用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用來(lái)檢測(cè)。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定微囊藻毒素不僅能定量，還能夠區(qū)分MC異構(gòu)體，但在樣品前處理過(guò)程中，不同固相萃取柱、淋洗劑、洗脫劑以及濃縮方式都會(huì)直接影響微囊藻毒素的回收率。本文建立以固相萃取分離，利用高效液相色譜一電噴霧電離質(zhì)譜（HPLCIESI-MS）檢測(cè)微囊藻毒素的方法；研究不同固相萃取柱、濃縮方式、優(yōu)化氮吹儀參數(shù)、優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)等因素對(duì)微囊藻毒素一LR分析結(jié)果的影響。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Wacers高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜；Masslynx4.0工作站；Zymark全自動(dòng)固相萃取儀；HLB固相萃取小柱（500mg，6mL）；C18固相萃取小柱（500mg，6mL）；全自動(dòng)定量氮吹儀；普通氮吹儀。甲醇、甲酸均為色譜純；水由Millipore純水機(jī)制備；MCYST-LR標(biāo)樣購(gòu)自Alexs公司。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry300，C18柱（4.6mm×75mmx3.5μm，孔徑300xl0-10m），柱溫：30℃；樣品溫度：室溫，進(jìn)樣體積：10μL，體積流量：0.2mL/min。流動(dòng)相梯度見(jiàn)表l。

1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

離子源：ESI+，毛細(xì)管電壓：3.90kV，錐孔電壓：49V；離子源溫度：100℃，RF透鏡1：40.0，光圈：0.0，RF透鏡2：0.0，錐孔反吹氣體積流量：50L/h，脫溶劑氣溫度：350℃，脫溶劑氣流量：400L/h，碰撞池壓力：3.Oxl0-3Mbar（1bar=105Pa）。

質(zhì)量分析器：低端分辨率LM Lensl：12.OV，高端分辨率HM Lensl：12.0V，離子能量1：0.3，入口透鏡電壓：10V，碰撞梯度：1.0，995.8>135碰撞能量：54，995.8>375.1碰撞能量：50，出口電壓：12V，低端分辨率LM Lens2：12.OV，高端分辨率HM Lens2：12.OV，離子能量2：0.6。該實(shí)驗(yàn)考察了錐孔電壓和碰撞能量?jī)蓚€(gè)參數(shù)的優(yōu)化，錐孔電壓調(diào)節(jié)值設(shè)為36，42，49，52V，定量離子995.8>135碰撞能量調(diào)節(jié)值設(shè)為48，50，54，57；定性離子995.8>375.1碰撞能量調(diào)節(jié)值設(shè)為40，46，50，55，質(zhì)譜分析時(shí)比較對(duì)MC-LR檢出靈敏度的影響。

1.4 樣品前處理的優(yōu)化

用5mL甲醇、5mL水活化HLB小柱和C18小柱，流量為5 mL/min；取兩個(gè)空門水樣IL，分別加入MC-LR標(biāo)準(zhǔn)100ng，加入5mL甲醇上樣至固相萃取小柱，體積流量為4mUmin；用lOmL5%甲醇水溶液淋洗小柱，用氮?dú)獯蹈?0min，然后再用5mL甲醇洗脫兩次；合并洗脫液，并用氮吹儀濃縮至lmL，直接進(jìn)樣分析，根據(jù)加標(biāo)回收率的差異比較不同固相萃取小柱的富集效果。

同時(shí)取4個(gè)空門水樣，分別加入MC-LR標(biāo)準(zhǔn)100ng，采用固相萃取獲得有機(jī)相后，同時(shí)利用全自動(dòng)型氮吹儀和普通氮吹儀兩種濃縮方式，氮吹過(guò)程中多次用滴管涮洗氮吹瓶?jī)?nèi)壁，最終濃縮定容至lmL，直接進(jìn)樣分析，對(duì)比不同濃縮方式對(duì)回收率的影響。

取空門水樣分別加入MC-LR標(biāo)準(zhǔn)100ng，固相萃取后采用普通氮吹濃縮樣品，調(diào)節(jié)一定的水浴溫度，同時(shí)緩慢吹入氮?dú)獯得撨M(jìn)行濃縮。氮?dú)怏w積流量設(shè)為0.5，1，1.5，2L/min；水浴溫度設(shè)為36，37，38，40℃；濃縮定容至lmL直接進(jìn)樣分析，對(duì)比不同氮?dú)饬髁亢退囟葘?duì)回收率的影響。

2.結(jié)果與討論

2.1 不同固相萃取柱對(duì)微囊藻毒素測(cè)定結(jié)果的影響

采用硅膠鍵合Sep-Pak C18和以聚合物為填料的Oasis HLB兩種小柱富集微囊藻毒素，按照上述1.4方法進(jìn)行樣品前處理，比較兩種小柱的富集效果。結(jié)果表明，Oasis HLB小柱回收率與Sep-PakC18小柱相比提高了20%～25%。由此可見(jiàn)，兩種小柱的富集效果有明顯差異，對(duì)于極性強(qiáng)的MC-LR，Oasis HLB小柱的富集效率顯著高于Sep-Pak C18小柱；因?yàn)镠LB小柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有較大的吸附容量；與C18小柱相比，同樣容量規(guī)格的HLB小柱吸附劑的表面積增大2～3倍，對(duì)極性強(qiáng)的MC-LR富集效率就更高。鑒于HLB固相萃取柱操作簡(jiǎn)便、快速，并具有較大吸附能力，所以本方法采用HLB柱。

2.2 不同濃縮方式對(duì)MCYST-LR回收率的影響

該研究采用固相萃取獲得有機(jī)相后，用普通氮吹代替全自動(dòng)氮吹，按照上述樣品前處理方法1.4進(jìn)行分析。取4個(gè)空門水樣500mL，分別加入MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品100ng、200ng，考察手動(dòng)氮吹儀和全自動(dòng)型氮吹儀兩種濃縮方式對(duì)MCYST-LR回收率的影響，見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，采用普通氮吹濃縮，微囊藻毒素回收效果更佳，相對(duì)于全自動(dòng)型氮吹，用滴管涮洗氮吹瓶?jī)?nèi)壁是關(guān)鍵步驟，很大程度地減少了待測(cè)組分的損失，提高了回收率。

2.3 優(yōu)化氮吹儀參數(shù)

本文采用普通氮吹濃縮樣品，調(diào)節(jié)一定的水浴溫度，同時(shí)緩慢吹入氮?dú)獯得撨M(jìn)行濃縮按照上述樣品前處理方法1.4進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)考察了氮?dú)饬髁亢退囟葍蓚€(gè)參數(shù)對(duì)MCYST-LR回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2與圖3。氮吹濃縮時(shí)，氮?dú)怏w積流量允許范圍為0.5～2.0L/min，加熱的原則是增加溶劑揮發(fā)速度的同時(shí)盡量保證目標(biāo)物的保留，水浴溫度范圍為36-40℃。由圖可知，氮?dú)怏w積流量調(diào)節(jié)為1.5Lmin，水浴溫度調(diào)節(jié)為38℃，回收效果更佳，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化這兩個(gè)參數(shù)，回收率明顯提高，因?yàn)榈獨(dú)鈮毫档停囟嚷晕⒔档?，減少目標(biāo)化合物在濃縮過(guò)程中的損失，但是氮?dú)鈮毫Σ荒苓^(guò)低，壓力過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)濃縮樣品的時(shí)間。

2.4 錐孔電壓和碰撞能量對(duì)MCYST-LR靈敏度

的影響

根據(jù)各種MCYST分子結(jié)構(gòu)，選擇ESI（+）作為電離化模式，將MCYST-LR標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成lμg/mL的甲醇溶液，通過(guò)全掃描方式找出其母離子m/z995.8，使用Daughter掃描的方式選擇特征離子，逐步加大誘導(dǎo)碰撞能量，隨著母離子豐度逐漸減少，子離子豐度逐漸增加。選碎片離子m/z135作為L(zhǎng)R的定量離子，m/z375.1作為L(zhǎng)R的定性離子，最后在MRM方式中進(jìn)一步調(diào)整碰撞能量，確定其最佳誘導(dǎo)碰撞能量的范圍。實(shí)驗(yàn)考察了錐孔電壓和碰撞能量?jī)蓚€(gè)參數(shù)對(duì)MCYST-LR檢測(cè)靈敏度的影響，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，定量離子995.8>135錐孔電壓調(diào)節(jié)為49，碰撞能量調(diào)節(jié)為54時(shí)；定性離子995.8>375.1錐孔電壓調(diào)節(jié)為49，碰撞能量調(diào)節(jié)為50時(shí)，MCYST-LR靈敏度更高，響應(yīng)值最大。

3.結(jié)束語(yǔ)

由上述結(jié)果可以看出，前處理方法和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化對(duì)微囊藻毒素-LR測(cè)定的影響非常顯著，與C18小柱相比，同樣容量規(guī)格的HLB小柱吸附劑的表面積增大2～3倍，對(duì)極性強(qiáng)的MC-LR富集效卒就更高；濃縮方式采用普通氮吹儀回收效果更佳；氮吹濃縮時(shí)氮?dú)怏w積流量調(diào)節(jié)為1.5L/min，水浴溫度調(diào)節(jié)為38℃，回收效果較好；質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，錐孔電壓和碰撞能量這兩個(gè)參數(shù)對(duì)微囊藻毒素-LR檢測(cè)靈敏度的影響較顯著，優(yōu)化后定量離子995.8>135錐孔電壓調(diào)節(jié)為49，碰撞能量調(diào)節(jié)為54時(shí)；定性離子995.8>375.1錐孔電壓調(diào)節(jié)為49，碰撞能量調(diào)節(jié)為50時(shí)，MCYST-LR靈敏度更高，響應(yīng)值最大。

本文考察了濃縮方式、固相萃取柱、氮吹過(guò)程中的參數(shù)、質(zhì)譜參數(shù)等前處理方法中涉及的因素比較，提出優(yōu)化措施，使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程更為實(shí)用簡(jiǎn)便，同時(shí)顯著提高了微囊藻毒素-LR的回收率。應(yīng)用優(yōu)化后的微囊藻毒素-LR前處理?xiàng)l件和液相色譜聯(lián)用電離質(zhì)譜法檢測(cè)，能夠取得更為理想的分析效果，對(duì)于微囊藻毒素-LR液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的推廣應(yīng)用具有重要參考價(jià)值。