摘要：建立LC-MS同時(shí)檢測大鼠腦脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的方法。采用安捷倫ZORBAX SIL（ 4.6 mm×250mmx5μm）硅膠正相色譜柱，流動(dòng)相為甲醇一水（O.l%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脫，流速為1mUmin。電噴霧離子源（eletmspray ionization，ESI）采用正離子化方式，以多重反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）方式進(jìn)行檢測，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為，77/2 148.1--m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m /z 104.1一m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。測定大鼠腦脊液中谷氨酸在500～2500IJg/L和y一氨基丁酸在50～250卜Lg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，適用于腦脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的同時(shí)測定，可為氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)提供有效的檢測手段。

關(guān)鍵詞：液質(zhì)聯(lián)用法；谷氨酸；y-氨基丁酸；腦脊液

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（ 2015） 02-0050-04

引 言

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是人類腦組織中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，包括興奮性及抑制性兩類。其中，谷氨酸（Glu）是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，y一氨基丁酸（GABA）是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。存在于腦組織和腦脊液中的這些氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)具有重要作用，其含量及比例的變化伴隨著多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。因此，氨基酸含量的檢測對(duì)于某些疾病的篩查、診斷和治療具有重要意義。

目前，測定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的常用方法是高效液相色譜法（HPLC）和氨基酸自動(dòng)分析儀法。但是由于氨基酸無紫外吸收，需要柱前衍生才能進(jìn)行檢測，操作步驟繁瑣，耗時(shí)耗力；并且柱前衍生會(huì)使得氨基酸的測定結(jié)果存在不確定性。本文采用液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，建立了對(duì)大鼠腦脊液中兩種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)快速同時(shí)分析的方法。該方法的重現(xiàn)性好，靈敏度和選擇性高，測定較為準(zhǔn)確，分析步驟簡單，提高了分析效率?？蓱?yīng)用于腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的分析測定，為臨床檢測提供可靠的技術(shù)手段。

1.儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260 series）；液質(zhì)聯(lián)用儀（6410B.安捷倫三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜）；電子天平（CP225D，德國賽多利斯公司）；氮吹儀（MTN-2800D，天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；超純水儀（RIOs5.密理博中國有限公司）；旋渦混合器（XW-80A，上海青浦瀘西儀器廠）；離心機(jī)（TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器）。

1.2 材料

Glu（批號(hào)：100023-198601）、GABA（批號(hào)：100023-198601）均由中國藥品生物制品檢定所提供。色譜級(jí)甲醇、乙腈購白賽默飛世爾公司，其他試劑為市售分析純。超純水自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性大鼠6只，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（川）2008-19。

2.方法

2.1 色譜條件

安捷倫ZORBAX SIL（4.6 mmx250mmx5μm）硅膠正相色譜柱；流動(dòng)相甲醇一水（0.1%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脫系統(tǒng)如表l所示，流速為1 mL/min，柱后分流，分流比為1：3，進(jìn)樣量為2μL，柱溫40℃。

2.2 質(zhì)譜條件

安捷倫三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜，干燥氣為氮?dú)?，干燥氣溫度?50℃，干燥氣流速：11L/min.電噴霧離子源（ESI），毛細(xì)管電壓：4kV，霧化氣壓力：40 psi（lpsl=6.895 KPa），裂解電壓：75V，離子化方式為正模式。碰撞能量：15 V（谷氨酸）、10V（y一氨基丁酸），碰撞池加速電壓：3V，檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方法，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為， m/Z148.1一m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m/z 104.1—m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。

2.3 樣品溶液的制備

體外穿刺抽取大鼠腦脊液約100μL，按照1：4（v∶v）加甲醇沉淀蛋白，充分振蕩混合，離心20 min（轉(zhuǎn)速12 000 r/min）.取上層清液用氮吹儀吹干，加0.4mL流動(dòng)相B互溶，離心lOmin（轉(zhuǎn)速12000r/min）后取上清液待測。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

由于腦積液中存在內(nèi)源性的Glu和GABA.無空白樣本，故精密稱取Glu對(duì)照品與GABA對(duì)照品各5 mg，流動(dòng)相B定容到10mL，再分別取200μL流動(dòng)相B定容到10mL，配成質(zhì)量濃度為10mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取250，500，750，1000，1250μL Glu（10mg/L）與25，50，75，100，125μL GABA（lOmg/L）至5 mL容量瓶中，流動(dòng)相B定容，得到質(zhì)量濃度分別為500，1000，1500，2 000，2 5001Lg/L和50， 100， 150，200，250μg/L的系列混合對(duì)照品溶液，冷藏備用。

3.結(jié)果

3.1 方法專屬性考察

取對(duì)照品溶液和腦脊液樣品溶液按照2.1和2.2的條件，分別進(jìn)樣2μL，結(jié)果Glu的保留時(shí)間約為7.9min.GABA的保留時(shí)間約為11.5min，腦脊液中的內(nèi)源性成分不干擾樣品的測定（如圖1～圖4所示）。

3.2 定量限

分別取Glu和GABA對(duì)照品溶液，逐步稀釋，分別進(jìn)樣2μL，當(dāng)信噪比SNR=10時(shí)，得到Glu和GABA定量限質(zhì)量濃度分別為8.12μg/L。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取2.4Glμ和GABA系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2μL，記錄Glμ及GABA峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（μg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=6.864x+1361.ll，r2=0.9989和y=4.333x+81.41，r2=0.9994。結(jié)果表明：Glu和GABA在500～2 500μg/L和50～250μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取Glu和GABA對(duì)照品貯備液適量，用流動(dòng)相B稀釋成質(zhì)量濃度分別為500，1 000.2000μg/L和50，100，200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣2μL，結(jié)果表明Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品精密度良好（見表2和表3）。

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一大鼠腦脊液100μL，平行操作5份，按照2.3的操作進(jìn)行處理，在2.1和2.2的條件下進(jìn)行測定，計(jì)算GJlu和GJABA的峰面積的RSD，結(jié)果見表4。

3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取同一大鼠腦脊液5份，每份50μL。分別加入50μL Glu（5000μg/L）和GABA（600μg/L）的對(duì)照品溶液，然后再加入400μL的甲醇，充分振蕩混合，離心20min（轉(zhuǎn)速12000r/min）.取上層清液用氮吹儀揮干，加0.4mL流動(dòng)相B互溶，離心10min（轉(zhuǎn)速12000r/min）后取上清2μL進(jìn)樣測定，回收率結(jié)果見表5。

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按2.3的方法分別制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（Glu 600，1200，2400μg/L和GABA 65，110，220μg/L）的樣品溶液，分別在室溫（放置6，12，24h）、長時(shí)間凍存（-25℃凍存l，2，3周）和凍融（凍融1，2，3次）條件下進(jìn)行色譜測定，結(jié)果低、中、高3種質(zhì)量濃度的RSD分別為（Glu 5.65%、4.24%、3.87%和GABA 4.39%、3.18%、3.08%）.

3.8 質(zhì)量濃度測定結(jié)果

按2.3的方法制備大鼠腦脊液樣品5份，分別進(jìn)樣2μL，質(zhì)量濃度水平見表6。

4.結(jié)束語

文獻(xiàn)采用LC-MS方法測定GIμ和GABA的含量，由于GIμ和GABA為強(qiáng)極性化合物，反向色譜柱對(duì)此類化合物幾乎沒有保留，使得樣品出峰時(shí)間較早、基質(zhì)影響較大和樣品峰未完全分離。故采用硅膠正相色譜柱，使樣品出峰時(shí)間推后到7.9～12min，避免了雜質(zhì)的干擾；同時(shí)，由于使用5μm的普通液相色譜柱進(jìn)行分離，為保證最佳的分離效果和質(zhì)譜檢測效果，使用1mL/min流速，1：3柱后分流。在反向色譜系統(tǒng)中使用正相色譜柱，實(shí)現(xiàn)了樣品與樣品、樣品與基質(zhì)間的完全分離，但較長時(shí)間使用后存在一定的柱流失，這樣會(huì)影響離子化效率，需要及時(shí)清洗。

分別考察了甲醇和乙腈組成的流動(dòng)相體系，以及甲酸和乙酸的加入對(duì)樣品的離子化作用和酸加入量對(duì)樣品測定的影響。甲醇和乙腈組成的流動(dòng)相體系等體積時(shí)樣品分離效果均不理想，采用梯度洗脫后均能實(shí)現(xiàn)樣品較好分離，從經(jīng)濟(jì)性考慮，選擇甲醇作為流動(dòng)相。甲酸和乙酸均能增強(qiáng)樣品的離子化效率，但甲酸的效果好于乙酸，同時(shí)酸的加入量比較了0.05%.0.1%，0.2%.0.3%條件下的離子化效果，最終選擇加入0.1%甲酸。

對(duì)干燥氣溫度、裂解電壓和碰撞能量等質(zhì)譜條件進(jìn)行了篩選，最后確定Glu和GABA的檢測干燥氣溫度為350℃，裂解電壓為75V，碰撞能量Glu為15V，GABA為10V，采用正離子模式多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方法。

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜一電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）法對(duì)大鼠腦脊液中Glu和GABA的快速同時(shí)檢測方法。樣品前處理簡單，無需衍生化可以直接測定。檢測時(shí)間短，可為臨床診斷提供可靠的檢測手段，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和治療提供參考。