周紀(jì)東，李余 動(dòng)

黃花菜多糖的提取、結(jié)構(gòu)性質(zhì)及抑菌活性

周紀(jì)東1，李余 動(dòng)2

（1.浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

采用水提醇沉法，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究黃花菜粗多糖（crude polysaccharides from Hemerocallis citrina Baroni，CPH）的提取工藝，并利用Sevag法和H2O2氧化法提純制備黃花菜精制多糖（deproteinized polysaccharides from Hemerocallis citrina Baroni，DPH），通過理化檢驗(yàn)和紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜分析，考察DPH的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，同時(shí)還研究DPH對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母、黑曲霉的抑制作用。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，CPH最優(yōu)提取條件為浸提溫度75 ℃、浸提時(shí)間3 h、液固比20∶1（mL/g）、浸提2 次。在此條件下，CPH提取率為28.36%。理化性質(zhì)、光譜與色譜特征表明，DPH是一種具有α-型吡喃糖苷結(jié)構(gòu)的水溶性雜多糖，是由L-鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成，且可能是一種與蛋白質(zhì)或多肽以共價(jià)鍵結(jié)合的糖復(fù)合物。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DPH對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌具有明顯的抑制作用，相應(yīng)的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為10、10、25 mg/mL。

黃花菜；多糖；提取工藝；性質(zhì)；抑菌活性

黃花菜屬百合科萱草屬多年生草本植物，又名金針菜、忘憂草，其花可食用，為我國(guó)特產(chǎn)蔬菜，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、具有多種保健功能的花卉珍品蔬菜，還是一味良藥，其花、葉、根曬干后均可入藥用[1-2]?！侗静菥V目》中稱其有安神醒腦、增智寬胸、美容養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效[3]。黃花菜富含胡蘿卜素、氨基酸和多糖等[4-5]。大量研究表明，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)[6-7]、抗腫瘤[7-8]、抗炎[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11-12]、抗輻射[13]、降血糖[14]、保濕[11]、保肝[12]等多種功能，由于其毒副作用小、安全性強(qiáng)、功能多等特點(diǎn)而被越來越多的人所關(guān)注，其相關(guān)研究也日益受到重視。

近年來，已有學(xué)者深入研究開發(fā)了黃花菜的栽培技術(shù)，有關(guān)黃花菜中化學(xué)成分及其生物活性的研究也已展開，其中關(guān)于黃酮、多酚等化合物的報(bào)道較多[15-19]，但有關(guān)黃花菜中多糖的研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)就黃花菜多糖的提取條件、含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)性質(zhì)及抑菌活性等進(jìn)行了研究，以期為深度開發(fā)利用黃花菜這一豐富資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

黃花菜樣品采自浙江省桐廬縣分水鎮(zhèn)，經(jīng)杭州市植物園盧毅軍高級(jí)工程師鑒定為百合科萱草屬黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（CGMCC 1.2387）、大腸桿菌（Escherichia coli）（CGMCC 1.3373）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CGMCC 1.2155）、白假絲酵母（Candida albicans）（CGMCC 2.4090）、黑曲霉（Aspergillus niger）（CGMCC 3.6327） 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-山梨糖 上海試劑二廠；葡萄糖醛酸 美國(guó)Sigma公司；木瓜蛋白酶美國(guó)Merck公司。

胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制見《中國(guó)藥典》附錄[20]。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；752W紫外-可見分光光度計(jì) 上海朗伯儀器有限公司；Anke TDL-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DZF-6021真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Wzz-2A數(shù)字式自動(dòng)旋光儀 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器 金壇國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHP-25電熱恒溫培養(yǎng)箱 常州邁科諾儀器有限公司；Nicolet nexus 470紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司；2695高效液相色譜儀（配有2414差示折光檢測(cè)器、2487雙λ波長(zhǎng)檢測(cè)器）美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取工藝流程

黃花菜樣品→預(yù)處理→浸提→過濾→濃縮→醇析沉淀→離心分離→黃花菜粗多糖（crude polysaccharides from Hemerocallis citrina Baroni，CPH）→復(fù)溶→除蛋白→脫色→純化→黃花菜精制多糖（deproteinized polysaccharides from Hemerocallis citrina Baroni，DPH）

預(yù)處理：黃花菜樣品于60 ℃干燥至質(zhì)量恒定，用粉碎機(jī)磨成粉末，過400 目篩備用。取適量黃花菜粉末用濾紙包好，放入索氏提取器，用石油醚60～90 ℃回流脫脂3 h。將脫脂后的濾紙包風(fēng)干，用80%乙醇溶液85 ℃回流6 h，以除去樣品中單糖、寡糖等，最后自然風(fēng)干濾渣。

濃縮：熱水浸提液用3 層紗布過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約100 mL。

醇析：向濃縮液中緩慢加入4 倍體積的無水乙醇，用玻璃棒緩慢攪拌，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，4 ℃靜置24 h，4000 r/min離心10 min，收集沉淀即為CPH。

除蛋白與脫色：將CPH復(fù)溶于水，采用中性酶-Sevag法[21]除去蛋白質(zhì)和H2O2氧化法[22]脫色。

純化：將多糖水溶液透析36 h后減壓濃縮，再次醇析沉淀，離心，所得沉淀分別用95%乙醇、無水乙醇、丙酮溶液各洗3 次，60 ℃真空干燥得DPH。

1.3.2 熱水浸提工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以CPH提取率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)分別研究浸提溫度、浸提液pH值、浸提時(shí)間、液固比、浸提次數(shù)對(duì)CPH提取率的影響，提取率計(jì)算見式（1）。

1.3.2.1 浸提溫度對(duì)CPH提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份各10 g黃花菜樣品，經(jīng)過預(yù)處理后，以液固比25∶1（mL/g）、浸提液pH 7.0、浸提2 h、浸提1 次為不變條件，研究不同浸提溫度（60、70、80、90、100 ℃）對(duì)CPH提取率的影響。

1.3.2.2 浸提液pH值對(duì)CPH提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份各10 g黃花菜樣品，經(jīng)過預(yù)處理后，以液固比25∶1（mL/g）、浸提溫度80 ℃、浸提2 h、浸提2 次為不變條件，研究不同pH值（5、6、7、8、9）的浸提液對(duì)CPH提取率的影響。

1.3.2.3 浸提時(shí)間對(duì)CPH提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6 份各10 g黃花菜樣品，經(jīng)過預(yù)處理后，以液固比25∶1（mL/g）、浸提溫度80 ℃、浸提液pH7.0、浸提1 次為不變條件，研究不同浸提時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）對(duì)CPH提取率的影響。

1.3.2.4 液固比對(duì)CPH提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6 份各10 g黃花菜樣品，經(jīng)過預(yù)處理后，以浸提溫度80 ℃、浸提液pH7.0、浸提2 h、浸提1 次為不變條件，研究不同液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL/g））對(duì)CPH提取率的影響。

1.3.2.5 浸提次數(shù)對(duì)CPH提取率的影響

準(zhǔn)確稱取4 份各10 g黃花菜樣品，經(jīng)過預(yù)處理后，以液固比25∶1（mL/g）、浸提溫度80 ℃、浸提液pH 7.0、浸提3 h為不變條件，研究不同浸提次數(shù)（1、2、3、4）對(duì)CPH提取率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定正交試驗(yàn)的因素水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以CPH提取率為考察指標(biāo)，研究CPH浸提工藝參數(shù)的最佳組合。

1.3.4 多糖含量測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線建立采用苯酚-硫酸法[23]，所得回歸方程為A=0.008 7ρ（R=0.999 7，n=6），式中A為490 nm波長(zhǎng)處吸光度，ρ為葡萄糖溶液質(zhì)量濃度/（μg/mL）。該標(biāo)準(zhǔn)曲線在葡萄糖溶液質(zhì)量濃度5.00～80.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.4.2 換算因子的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取3 份各20 mg DPH，分別用蒸餾水溶解，定容到100 mL。準(zhǔn)確移取0.3 mL按照1.3.4.1節(jié)中所述方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)式（2）計(jì)算換算因子。

式中：f為換算因子；m為DPH含量/（μg/mL）；ρ為DPH供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；d為多糖的稀釋倍數(shù)。計(jì)算求得DPH相對(duì)于葡萄糖的換算因子f=1.518（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.13%，n=3）。

1.3.4.3 樣品中多糖含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取6 份各10 g黃花菜樣品，按照1.3.1節(jié)中多糖提取工藝（優(yōu)化后）分別制備出CPH和DPH各3份，分別用蒸餾水溶解，定容到500 mL，稀釋100 倍后準(zhǔn)確移取1 mL按照1.3.4.1節(jié)中所述方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)式（3）計(jì)算黃花菜樣品中多糖含量。

式中：w為多糖含量/%；ρ為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；d為樣液的稀釋倍數(shù)；f為換算因子；M為樣品含量/（μg/mL）。

1.3.5 多糖的理化性質(zhì)及成分含量測(cè)定

物理性質(zhì)參考文獻(xiàn)[23]，測(cè)定DPH在水及幾種主要有機(jī)溶劑中的溶解性及比旋光度?；瘜W(xué)性質(zhì)參考文獻(xiàn)[23]，測(cè)定進(jìn)行包括碘-碘酸鉀反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)、費(fèi)林試劑反應(yīng)、Molish反應(yīng)。

中性多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[23]，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用微量凱氏定氮法，糖醛酸含量測(cè)定采用硫酸-咔唑法，灰分含量測(cè)定采用總灰分測(cè)定法[24]。

1.3.6 多糖的紫外光譜性質(zhì)

配制2 mg/mL DPH溶液，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以蒸餾水作為空白。

1.3.7 多糖的紅外光譜性質(zhì)

將2 mg DPH與100 mg溴化鉀純品混合，研細(xì)均勻，壓成透明薄片，在500～4 000 cm-1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.8 多糖的單糖組分分析

將1 mg DPH用2 mol/L硫酸于100 ℃封管水解8h，水解產(chǎn)物經(jīng)碳酸鋇中和，得到單糖供試液進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，以單糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。色譜柱為NUCLEOGEL SUGARPb色譜柱（300 mm×7.7 mm），洗脫劑為超純水，流速為0.6 mL/min，柱溫為80 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.9 DPH的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.9.1 菌懸液制備

將銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母、黑曲霉5 種供試菌株活化后分別制備原始菌液（或孢子液），采用比濁法以無菌生理鹽水分別稀釋成107～108CFU/mL菌懸液（或孢子懸液）[20]。

1.3.9.2 抑菌效果評(píng)價(jià)

每個(gè)平皿中，先將純瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒入10 mL，冷卻，作為平板底層。溶化各供試菌培養(yǎng)基，待冷卻至50～55 ℃，分別將5 種供試菌稀釋菌懸液（或孢子懸液）加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中充分混勻至105～106CFU/mL，再向各自平皿中瓊脂底層上倒入10 mL，冷卻。每種供試菌株做3 個(gè)重復(fù)。

每個(gè)平板表面上，等間距均勻放置3 個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中均準(zhǔn)確加入200 μL 500 mg/mL DPH溶液。每個(gè)平板先放置于4 ℃冰箱中擴(kuò)散10 h，然后細(xì)菌所在平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，霉菌及酵母所在平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按時(shí)取出后，測(cè)量每個(gè)牛津杯周圍所產(chǎn)生的透明抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值，比較抑菌效果。

1.3.9.3 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定

將DPH溶液稀釋成250、100、50、25、10、5 mg/mL的質(zhì)量濃度梯度，分別研究不同質(zhì)量濃度DPH溶液對(duì)5 種供試菌株的MIC，實(shí)驗(yàn)過程與1.3.9.2節(jié)中相同，以出現(xiàn)抑菌圈的最低質(zhì)量濃度為MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提溫度對(duì)CPH提取率的影響

圖 1 浸提溫度對(duì)CPH提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on CPH yield

如圖1所示，隨著浸提溫度升高，CPH提取率不斷增大，80 ℃時(shí)達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)升高提取率反而逐漸下降。由此推測(cè)，高溫對(duì)CPH的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性有一定影響，所以80 ℃是CPH浸提的合適溫度。

2.1.2 浸提液pH值對(duì)CPH提取率的影響

圖 2 浸提液pH值對(duì)CPH提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent pH on CPH yield

如圖2所示，隨著浸提液pH值升高，CPH提取率有所提高，pH 7時(shí)達(dá)到最大值，pH值大于7后呈下降趨勢(shì)。由此推測(cè)，浸提時(shí)間較長(zhǎng)，浸提液過酸或過堿均會(huì)破壞CPH的立體結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性。因此，浸提時(shí)不必調(diào)節(jié)浸提液pH值。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)CPH提取率的影響

圖 3 浸提時(shí)間對(duì)CPH提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on CPH yield

如圖3所示，隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)，CPH提取率有所增大，3 h后逐漸回落并趨于穩(wěn)定。為了提高效率，減少能耗，浸提時(shí)間以3 h為宜。

2.1.4 液固比對(duì)CPH提取率的影響

如圖4所示，隨著液固比增加，CPH提取率逐漸增大，當(dāng)液固比達(dá)到25∶1（mL/g）后，不再增大并趨于穩(wěn)定。鑒于后續(xù)的濃縮工藝，所以選擇液固比為25∶1（mL/g）為宜。

圖 4 液固比對(duì)CPH提取率的影響Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio on CPH yield

2.1.5 浸提次數(shù)對(duì)CPH提取率的影響

圖 5 浸提次數(shù)對(duì)CPH提取率的影響Fig.5 Effect of repeated extraction number on CPH yield

如圖5所示，第1次浸提得到的多糖最多，隨著浸提次數(shù)的增加，每次浸提到的CPH質(zhì)量越來越少，至第4次浸提到的多糖質(zhì)量?jī)H增加了0.35%。由此推測(cè)，持續(xù)高溫條件下浸提可能會(huì)造成CPH降解。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，浸提次數(shù)應(yīng)不超過3 次。

2.2 熱水浸提工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

表 1 正交試驗(yàn)因素水平、方案及結(jié)果Table 1 Factors and their coded levels, design scheme, results and range analysis of orthogonal array

由表1可知，根據(jù)極差分析結(jié)果，4 個(gè)因素對(duì)多糖提取率影響的主次順序是：浸提溫度（A）＞浸提次數(shù)（D）＞浸提時(shí)間（B）＞液固比（C），最佳組合為A1B2C1D2，即浸提工藝參數(shù)為浸提溫度75 ℃、浸提時(shí)間3 h、液固比20∶1（mL/g）、浸提2 次。按照此最佳組合條件進(jìn)行浸提工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示CPH提取率為28.36%（RSD為2.04%，n=3）。

2.3 樣品中多糖的含量

1.3.4 節(jié)中所得CPH和DPH的供試液分別測(cè)得吸光度，代入公式計(jì)算得CPH和DPH多糖占樣品含量分別為20.71%（RSD為2.36%，n=3）、14.92%（RSD為2.85%，n=3）。由此表明，在經(jīng)過除蛋白、脫色等純化工藝過程中，樣品多糖含量有所損失。

2.4 多糖的理化性質(zhì)及成分含量

DPH為白色粉末，可溶于冷水，易溶于熱水、稀酸、稀堿，不溶于乙醇、乙醚、石油醚、丙酮等有機(jī)試劑，比旋光度[α]D20=＋112.75°（RSD為1.08%，n=3）。

DPH的碘-碘酸鉀反應(yīng)呈陰性，表明不含淀粉；硫酸-咔唑反應(yīng)呈陽性，表明其含有糖醛酸；費(fèi)林試劑反應(yīng)呈陰性，表明不含還原糖；Molish反應(yīng)呈陰性，表明不含單糖和二糖。綜上所得，DPH是一種水溶性、非淀粉、非果膠、不含單糖和二糖的多糖。

DPH中蛋白質(zhì)含量為1.67%（RSD為2.80%，n=3），中性多糖含量為68.31%（RSD為1.12%，n=3），糖醛酸含量為20.98%（RSD為1.34%，n=3），灰分含量為0.43%（RSD為10.75%，n=3）。

2.5 DPH的紫外光譜分析

圖 6 DPH的紫外吸收光譜圖Fig.6 UV spectrum of DPH

由圖6所示，DPH在200 nm波長(zhǎng)處存在顯著的多糖特征吸收峰，至260 nm波長(zhǎng)處未見核酸的特征吸收峰，表明已除去核酸，至280 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)弱肩峰，表明仍含有蛋白質(zhì)。該結(jié)果與2.4節(jié)中DPH含有少量蛋白質(zhì)相一致。據(jù)此推測(cè)，DPH可能是一種與蛋白質(zhì)或多肽以共價(jià)鍵結(jié)合的糖復(fù)合物[25]。

2.6 DPH的紅外光譜分析

圖 7 DPH的紅外吸收光譜圖Fig.7 IR spectrum of DPH

由圖7所示，DPH具有一般多糖物質(zhì)的特征吸收峰（3 411、2 921、1 645、1 415、1 384、1 156、1 015、865、602、533 cm-1）。3 411 cm-1處強(qiáng)且寬的吸收峰是O—H、C—H和N—H伸縮振動(dòng)引起，且含有明顯的分子間氫鍵；2 921 cm-1吸收峰是—CH2中C—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生；1 645 cm-1吸收峰是O—H彎曲振動(dòng)引起；1 415 cm-1吸收峰是C—H變角振動(dòng)引起；1 384 cm-1是C—N伸縮振動(dòng)與N—H彎曲振動(dòng)的混合吸收峰；1 156 cm-1是吡喃糖環(huán)的C—O吸收峰；1 015 cm-1吸收峰是O—H變角振動(dòng)引起；865 cm-1是α-型糖苷鍵吸收峰；602 cm-1吸收峰是N—H彎曲振動(dòng)引起；533 cm-1吸收峰是C—CO變形振動(dòng)引起[26]。其中，3 411、1 384、602 cm-13處吸收峰分析結(jié)果表明DPH中含有較多的酰胺鍵，且為仲酰胺，由此推測(cè)其含有蛋白質(zhì)，這與DPH的紫外吸收光譜分析結(jié)果相一致。綜上所得，DPH為典型的多糖類物質(zhì)，具有α-型吡喃糖苷結(jié)構(gòu)，且含有與其以共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽。

2.7 DPH的單糖組分分析

通過高效液相色譜分析，對(duì)照組中單糖標(biāo)準(zhǔn)品與DPH水解產(chǎn)物的單糖組分比對(duì)結(jié)果見表2。

表 2 DPH水解產(chǎn)物的高效液相色譜分析Table 2 HPLC analysis of hydrolyzed DPH

由表2可知，參照對(duì)照組中單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，可判斷DPH水解產(chǎn)物中含有L-鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，未檢測(cè)出L-巖藻糖、D-山梨糖和D-果糖。上述6 種檢出單糖均為吡喃型單糖，與紅外光譜分析結(jié)果相吻合。由此推測(cè)，DPH是一種由上述6 種單糖組成的雜多糖。

2.8 DPH的抑菌效果

表 3 DPH對(duì)不同菌株的抑菌效果Table 3 Inhibitory effects of DPH against different microorganismsTable 3 Inhibitory effects of DPH against different microorganisms

由表3可知，500 mg/mL DPH溶液對(duì)4 種供試菌株產(chǎn)生較為顯著的抑菌效果，其抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌＞銅綠假單胞菌＞大腸桿菌＞白假絲酵母，而對(duì)黑曲霉無抑菌效果。由于牛津杯外徑為7.8 mm，據(jù)此可知DPH對(duì)白假絲酵母的抑菌效果偏弱，而對(duì)其他3 種細(xì)菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌效果，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌。

2.9 DPH的MIC值測(cè)定結(jié)果

表 4 DPH的MIC值Table 4 MICs of DPH mm

由表4可知，DPH溶液質(zhì)量濃度的變化與其對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌3 種細(xì)菌的抑菌效果存在正相關(guān)，相應(yīng)的MIC值分別為10、10、25 mg/mL。相比而言，DPH溶液對(duì)白假絲酵母抑菌效果很弱，對(duì)黑曲霉無抑菌效果。綜上表明，DPH的抑菌作用具有一定的選擇性。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化黃花菜中提取多糖的工藝條件，結(jié)果表明提取CPH最適宜的工藝條件為：黃花菜干粉末先后使用石油醚、乙醇進(jìn)行脫脂、除去單糖和寡糖，然后以水為提取溶劑，采用提取條件為液固比20∶1（mL/g）、75 ℃浸提3 h、浸提次數(shù)2 次。按此浸提，多糖提取率為28.36%。進(jìn)一步利用中性酶-Sevag法和H2O2氧化法對(duì)CPH分別除去蛋白質(zhì)和脫色，提純制備出DPH。通過理化檢驗(yàn)和紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜分析，考察DPH的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，同時(shí)還研究DPH對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母、黑曲霉的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DPH是一種水溶性、非淀粉、非果膠、不含單糖和二糖的雜多糖，具有α-型吡喃糖苷結(jié)構(gòu)，主要是由L-鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成。紫外光譜分析和含量分析結(jié)果均顯示DPH中含有少量蛋白質(zhì)，至于其是否為與蛋白質(zhì)或多肽以共價(jià)鍵結(jié)合的糖復(fù)合物還需進(jìn)一步純化后再深入研究。此外，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DPH對(duì)細(xì)菌具有特異性的抑制作用，當(dāng)其溶液質(zhì)量濃度大于25 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用，尤以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。因此，DPH是一種潛在的天然抑菌劑，具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Extraction, Structural Characterization and Antimicrobial Activity of Polysaccharides from Hemerocallis citrina Baroni

ZHOU Jidong1, LI Yudong2
(1. Department of Biotechnology, Zhejiang Yuying Vocational Technology College, Hangzhou 310018, China；2. College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

The extraction of crude polysaccharides from Hemerocallis citrina Baroni (CPH) by water extraction and alcohol precipitation was optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array methods. After CPH was deproteinized by Sevag method and decolorized by H2O2oxidation method, the physicochemical properties and structure of the deproteinized polysaccharides from (DPH) were analyzed and characterized by UV spectrometry, infrared (IR) spectrometry and high performance liquid chromatography (HPLC). Meanwhile, the inhibitory activities of DPH against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans and Aspergillus niger were investigated. The results showed that the optimal conditions for CPH extraction were determined as two extraction cycles with distilled water at a solvent/solid ratio of 20:1 (mL/g) at 75 ℃ for 3 h. Under these conditions, the extraction yield of CPH was 28.36%. Meanwhile, DPH was water-soluble heteropolysaccharides which possessed the structure of α-pyranosides and consisted of L-rhamnose, D-xylose, L-arabinose, D-mannose, D-glucose and D-galactose. DPH was probably formed by conjugation of polysaccharides with proteins or polypeptides through peptide bonds. Furthermore, DPH had strong inhibitory activities against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli, their corresponding minimum inhibitory concentrations (MICs) were 10, 10, and 25 mg/mL, respectively.

Hemerocallis citrina Baroni； polysaccharides； extraction process； characterization； antimicrobial activity

R284.2

A

1002-6630（2015）08-0061-06

10.7506/spkx1002-6630-201508011

2014-09-14

浙江省教育科學(xué)規(guī)劃研究課題（SCG348）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101339）

周紀(jì)東（1976—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樯锎蠓肿又苽渑c應(yīng)用。E-mail：tristanzhou1976@sina.com