劉云濤，蘇艷，張寶江，蘇玲玲，姜慧嬌

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牛源金黃色葡萄球菌粘附因子Efb與ClfA的免疫生物學(xué)特性比較

劉云濤1，蘇艷1，張寶江1，蘇玲玲2，姜慧嬌1

1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 2 新疆畜牧科學(xué)院飼料研究所，新疆 烏魯木齊 830000

劉云濤, 蘇艷, 張寶江, 等. 牛源金黃色葡萄球菌粘附因子Efb與ClfA的免疫生物學(xué)特性比較. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1335–1343.Liu YT, Su Y, Zhang BJ, et al. Immunological comparison of Efb and ClfA of Staphylococcus aureusisolated from bovine. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1335–1343.

為評價(jià)與比較金黃色葡萄球菌的粘附因子Efb (Extracellular fibrinogen-binding protein) 和ClfA (Clumping factor A) 的抗原性、粘附特性及其抗血清對金黃色葡萄球菌菌體的識別能力、抗粘附能力及免疫保護(hù)力等免疫生物學(xué)特性，分別構(gòu)建Efb和ClfA的重組表達(dá)載體，并用純化的重組蛋白免疫實(shí)驗(yàn)動物，分別檢測家兔抗血清對菌體的識別能力、抗粘附能力以及小鼠抗血清的抗體效價(jià)和免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示，Efb和ClfA 均有與纖維蛋白原(Fibrinogen, Fg) 結(jié)合的能力，且Efb蛋白對纖連蛋白(Fibronectin, Fn) 的結(jié)合能力優(yōu)于ClfA (＜0.01)，ClfA免疫組抗血清對全細(xì)菌的識別能力優(yōu)于Efb免疫組(＜0.01)。與對照組相比Efb和ClfA免疫組的抗血清均能顯著抑制金黃色葡萄球菌對Fg和Fn的粘附(＜0.01)，Efb免疫組對金黃色葡萄球菌的粘附抑制優(yōu)于ClfA，兩種粘附因子免疫小鼠后產(chǎn)生的血清抗體效價(jià)與對照組比較有顯著的升高，抗體滴度可達(dá)1∶40 500，攻毒結(jié)果顯示Efb與ClfA免疫組均對小鼠具有良好的保護(hù)效果。該研究結(jié)果對Efb在金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

金黃色葡萄球菌，Efb，ClfA，免疫生物學(xué)特性

金黃色葡萄球菌作為一種重要的致病菌，廣泛存在于自然界，也是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一[1]。粘附素是金黃色葡萄球菌表達(dá)的一類特異性蛋白，能夠識別機(jī)體的細(xì)胞外基質(zhì)并與之發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)金黃色葡萄球菌粘附于宿主細(xì)胞表面，促進(jìn)細(xì)菌對宿主組織的入侵，尤其是在該菌感染的早期，粘附被認(rèn)為是細(xì)菌感染的重要一步，是構(gòu)成細(xì)菌感染的先決條件[2]。粘附素分子中聚集因子ClfA被認(rèn)為是在金黃色葡萄球菌表面最主要的粘附因子之一[3-4]。ClfA能介導(dǎo)病原菌與細(xì)胞表面的Fg的結(jié)合，ClfA的抗原決定表位位于配基結(jié)合的A區(qū)[5]。與ClfA分布于細(xì)胞表面不同，Efb是一種分泌至細(xì)胞外的Fg結(jié)合蛋白，目前Efb被認(rèn)為是在金黃色葡萄球菌感染過程中的一個(gè)關(guān)鍵致病因子[6]。Efb蛋白為一種雙功能蛋白，既能夠通過與Fg結(jié)合抑制血小板的凝集，同時(shí)又能夠抑制補(bǔ)體的激活[7-9]，因此Efb還是一個(gè)參與該菌免疫逃避的重要分子，研究其免疫對于防治其引起的感染具有重要意義。

ClfA和Efb這兩種粘附素均能夠與Fg結(jié)合，且ClfA被認(rèn)為在免疫原性及免疫保護(hù)特性方面具有非常明顯的優(yōu)勢。為深入認(rèn)識Efb分子在免疫原性及免疫保護(hù)特性方面的特點(diǎn)，本研究將ClfA和Efb分別進(jìn)行表達(dá)和免疫，通過對Efb免疫后抗血清對菌體的識別能力、抗粘附能力、抗體效價(jià)以及免疫保護(hù)效果與ClfA進(jìn)行對比，分析這兩種粘附素分子在抗原性、抗粘附特性以及免疫原保護(hù)特性方面的差異，進(jìn)而評估Efb作為免疫候選抗原的價(jià)值，為篩選和構(gòu)建金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株

牛乳源金黃色葡萄球菌新疆分離株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；原核表達(dá)載體pET-28a(+)、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3) 均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；家兔抗金黃色葡萄球菌血清由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、限制性內(nèi)切酶RⅠ、Ⅰ，La-DNA聚合酶，T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；纖維蛋白原 (F8630，65%?85%)、纖連蛋白 (F1141，1 mg/mL)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；Blue Plus II Protein marker、Ni-NTA Resin購自北京全式金生物技術(shù)公司；山羊抗鼠HRP-IgG、山羊抗兔HRP-IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液、DAB顯色液、考馬斯亮藍(lán)R-250購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

6?10月齡雌性健康新西蘭大白兔2.5 kg，5?7周齡雌性清潔級C57BL/6小鼠 (18?20 g)，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 Efb與ClfA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的金黃色葡萄球菌和基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，在上游引物中加入RⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物中加入Ⅰ酶切位點(diǎn)，引物序列見表1，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。以金黃色葡萄球菌分離株基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因和，經(jīng)RⅠ/Ⅰ酶切后的目的片段，連接到同樣經(jīng)RⅠ/Ⅰ酶切的pET-28a(+) 載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定挑取陽性克隆，由生工生物工程 (上海)股份有限公司測序。

1.5 重組蛋白的表達(dá)純化及Western blotting分析

將測序正確重組質(zhì)粒pET-28a-Efb與pET-28a-ClfA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，將陽性BL21(DE3) 菌種接種于LB培養(yǎng)基 (含50 μg/mL Kan)，并以pET-28a 作陰性對照，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至600值為0.6，加入 IPTG至終濃度1 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，分別取誘導(dǎo)表達(dá)前后菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行親和層析純化。

將重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。依次加入家兔抗金黃色葡萄球菌血清，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，在DAB顯色液中顯色，洗滌，觀察結(jié)果。

表1 引物序列及相應(yīng)的酶切位點(diǎn)

1.6 重組蛋白對Fg和Fn的結(jié)合活性測定

將重組蛋白以20 μg/孔分別與包被有Fg (200 ng/孔) 和Fn (50 ng/孔) 的酶標(biāo)板相互作用，37 ℃作用1 h，PBS洗滌3次，洗滌后以兔抗金黃色葡萄球菌血清為一抗 (稀釋度1∶100)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗 (稀釋度1∶6 000)，以TMB顯色，測定450值。

1.7 家兔免疫試驗(yàn)

將9只雌性成年健康新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組，每組3只，分別為Efb免疫組、ClfA免疫組和PBS對照組。首次免疫時(shí)抗原與弗氏完全佐劑等體積混合，第二次免疫和加強(qiáng)免疫抗原與弗氏不完全佐劑等體積混合。采用背部皮下多點(diǎn)注射方式，單次免疫劑量為200 μg/只，時(shí)間間隔均為21 d。初次免疫后14 d、35 d、42 d采血，分離血清–20℃保存。

1.8 Efb和ClfA兔抗血清抑制金黃色葡萄球菌粘附Fg、Fn能力的檢測

分別以5 μg/mL Fg 100 μL 和6.25 μg/mL Fn 100 μL 4 ℃過夜包被酶標(biāo)板[10-12]，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，同時(shí)將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌 (600=1.0) 與制備的免疫血清 (稀釋度1∶25、1∶100) 各100 μL 37 ℃孵育1 h，將孵育后的金黃色葡萄球菌加入到封閉后的酶標(biāo)板中，以對照組血清孵育的金黃色葡萄球菌作對照。37 ℃作用2 h，PBST洗滌3次，25%甲醛固定30 min，洗滌同上，結(jié)晶紫染色15 min，洗滌同上，最后用95%乙醇脫色5 min，測定405值。

1.9 小鼠免疫試驗(yàn)

將18只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為Efb免疫組、ClfA免疫組和PBS對照組，按50 μg/只皮下注射免疫，免疫程序同新西蘭大白兔免疫程序，進(jìn)行2次免疫。初次免疫后14 d、35 d、49 d、63 d采血，分析血清–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 小鼠免疫后血清抗體的檢測

用間接ELISA檢測免疫后的血清效價(jià)，選擇免疫后小鼠血清進(jìn)行抗體水平監(jiān)測。分別用2 μg/mL的Efb和ClfA蛋白包被酶標(biāo)板，以待檢血清為一抗，1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗，TMB為顯色液，測定450值。

1.11 Efb和ClfA小鼠抗血清對金黃色葡萄球菌結(jié)合能力的檢測

用5%戊二醛預(yù)處理酶標(biāo)板，加入滅活金黃色葡萄球菌200 μL/孔 (600=0.4)，37 ℃孵育16 h，加入不同稀釋度的待檢血清，37 ℃孵育 2 h，PBS洗滌3次，除去未結(jié)合的抗體，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃作用45 min，洗滌后以TMB顯色。

1.12 小鼠攻毒試驗(yàn)

首次免疫后76 d，取金黃色葡萄球菌接種于BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，每只小鼠攻毒量為2×109CFU (1MLD)，分別對Efb免疫組、ClfA免疫組和PBS對照組各小鼠進(jìn)行攻毒，攻毒后1周連續(xù)觀察并記錄小鼠死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，分別得到大小約為400 bp和1 600 bp的片段，經(jīng)測序鑒定后序列正確。表明成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Efb與pET-28a-ClfA。

2.2 重組蛋白的SDS-PAGE和Western blotting分析

對重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物分別在23 kDa (圖1A) 與90 kDa (圖1B) 處有明顯的蛋白條帶，說明Efb和ClfA融合蛋白表達(dá)成功。Western blotting 分析結(jié)果表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與兔抗金黃色葡萄球菌血清發(fā)生特異性反應(yīng) (圖2)，說明表達(dá)產(chǎn)物有良好的免疫原性。

圖1 Efb蛋白(A)和ClfA蛋白(B)的SDS-PAGE電泳

圖2 重組蛋白Efb (A)和ClfA (B) 的Western blotting分析

2.3 重組蛋白與Fg和Fn結(jié)合活性

分別用Fg (5 μg/mL) 和Fn (6.25 μg/mL) 包被酶標(biāo)板后檢測重組蛋白對二者的結(jié)合能力。檢測結(jié)果表明：與PBS對照組相比，重組蛋白Efb和ClfA均對Fg表現(xiàn)出明顯的結(jié)合能力 (<0.01)。重組蛋白Efb對Fn的結(jié)合能力明顯高于ClfA (<0.01)，該結(jié)果表明Efb在對Fn具有更強(qiáng)的結(jié)合優(yōu)勢 (圖3)。

2.4 重組蛋白抗血清抑制金黃色葡萄球菌粘附Fg和Fn能力檢測

在重組蛋白抗血清抑制金黃色葡萄球菌粘附Fg和Fn試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比Efb和ClfA免疫組抗血清均可抑制金黃色葡萄球菌對Fg和Fn的結(jié)合 (<0.01)，ClfA抗血清在抑制金黃色葡萄球菌對Fg的粘附方面優(yōu)于Efb (<0.01) (圖4A)，Efb抗血清在抑制金黃色葡萄球菌對Fn的粘附方面優(yōu)于ClfA (圖4B)。

2.5 重組蛋白免疫小鼠的血清抗體效價(jià)檢測

采用間接ELISA法檢測小鼠血清抗重組蛋白Efb和ClfA的特異性IgG水平 (圖5)。檢測結(jié)果表明第二次免疫14 d后，Efb蛋白免疫組與ClfA蛋白免疫組血清效價(jià)可達(dá)1∶40 500 (圖6)，二者均具有良好的抗體誘導(dǎo)能力。

2.6 重組蛋白小鼠抗血清結(jié)合金黃色葡萄球菌能力檢測

將1∶1 500、1∶4 500、1∶13 500稀釋的重組蛋白抗血清與包被的金黃色葡萄球菌作用2 h后，ELISA法檢測抗體對菌體的識別結(jié)合能力。結(jié)果顯示，ClfA蛋白免疫組抗血清對全細(xì)菌的結(jié)合能力優(yōu)于Efb (<0.05) (圖7)。

圖3 重組蛋白與Fg (A)和Fn (B)結(jié)合能力檢測

圖4 重組蛋白抗血清抑制金黃色葡萄球菌粘附Fg (A)和Fn (B) 能力檢測

圖5 Efb與ClfA免疫小鼠抗體的變化

圖6 ELISA測定Efb與ClfA鼠抗血清效價(jià)

圖7 重組蛋白抗血清結(jié)合金黃色葡萄球菌能力的ELISA檢測

2.7 不同粘附因子免疫小鼠的免疫保護(hù)率

免疫后76 d，選取牛源金黃色葡萄球菌菌株攻毒，攻毒后觀察小鼠死亡情況。結(jié)果顯示，攻毒后72 h，對照組全部死亡，Efb免疫組的存活率為83.3%，ClfA免疫組的存活率為100%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Efb與ClfA對金黃色葡萄球菌的攻擊均具有保護(hù)作用，ClfA的保護(hù)效力強(qiáng) 于Efb。

3 討論

在金黃色葡萄球菌感染的早期，粘附到上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的能力決定金黃色葡萄球菌的定居和繁殖，促進(jìn)細(xì)菌對宿主組織的入侵[2]。金黃色葡萄球菌在感染過程中可表達(dá)多種粘附素分子，這些粘附素分子可通過不同的機(jī)制與途徑和細(xì)菌表面結(jié)合，影響宿主對該菌的免疫識別，從而對感染的結(jié)果產(chǎn)生重要影響。

研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的持續(xù)感染與其能夠產(chǎn)生多種與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用的免疫調(diào)節(jié)分子有關(guān)[13]。補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的核心組分之一，尤其是C3組分可在補(bǔ)體激活中及在天然免疫與獲得性免疫的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[14]。Efb蛋白能夠與補(bǔ)體中的C3b組分結(jié)合而抑制補(bǔ)體的激活，進(jìn)而影響補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理和吞噬作用[6]。研究已證實(shí)Efb蛋白為一種雙功能蛋白，其既能夠通過與Fg結(jié)合，又能夠抑制補(bǔ)體的激活[7-9]，因此Efb不僅是金黃色葡萄球菌感染過程中的一個(gè)關(guān)鍵致病因子，還是參與該菌免疫逃避的重要分子。

以往對Efb的研究多集中于其免疫后的抗體對補(bǔ)體的抑制功能，對其免疫后抗體的粘附抑制和免疫保護(hù)特性進(jìn)行的研究較少。此外在金黃色葡萄球菌眾多粘附素分子中，ClfA被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌粘附于宿主細(xì)胞最主要的粘附因子之一[15]，ClfA的抗體可部分阻斷產(chǎn)生相應(yīng)粘附素的金黃色葡萄球菌對細(xì)胞的粘附[16]。Eric等研制的針對金黃色葡萄球菌ClfA的DNA疫苗，免疫小鼠可產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，卻不能在腹腔攻毒時(shí)提供保護(hù)[17]。這提示我們對多種粘附因子的抗原性、抗粘附特性及免疫保護(hù)特性進(jìn)行比較研究的必要性。

為深入認(rèn)識 Efb蛋白的免疫生物學(xué)特性及免疫保護(hù)效果，本研究分別表達(dá)了分離自牛乳腺炎的金黃色葡萄球菌的粘附素Efb和ClfA，比較二者的粘附特性并將Efb免疫后抗體的粘附抑制和免疫保護(hù)力與ClfA進(jìn)行對比，從而評估Efb在免疫方面的潛力和價(jià)值。

本研究以重組蛋白Efb與ClfA分別免疫小鼠，血清抗體檢測結(jié)果表明Efb與ClfA在免疫小鼠后均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。對重組蛋白Efb和ClfA與Fg和Fn的結(jié)合活性比較研究結(jié)果顯示，兩種重組蛋白均可結(jié)合Fg，重組蛋白Efb對Fn的結(jié)合活性大于蛋白ClfA (<0.01)。兩種蛋白對比后結(jié)果表明，Efb具有較強(qiáng)的Fn結(jié)合活性，明顯優(yōu)于ClfA對Fn的 結(jié)合。

在前期對Efb與ClfA研究的基礎(chǔ)上[18-19]，本研究進(jìn)一步將Efb蛋白免疫后抗血清的抗粘附能力和免疫保護(hù)力與ClfA蛋白免疫組進(jìn)行比較與分析，重組蛋白Efb與ClfA抗血清均可顯著抑制金黃色葡萄球菌對Fg和Fn的粘附 (<0.01)。Efb抗血清在抑制細(xì)菌對Fn的粘附方面優(yōu)于ClfA，而ClfA抗血清在抑制細(xì)菌對Fg的粘附方面優(yōu)于Efb。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)ClfA蛋白免疫小鼠血清抗體對細(xì)菌的親和力高于Efb蛋白免疫組，這與Melania 等的研究結(jié)果一致[20]。本研究免疫保護(hù)試驗(yàn)顯示ClfA在免疫保護(hù)方面優(yōu)于Efb, 因此推測Efb免疫后的抗體對菌體識別能力低于ClfA免疫組，可能導(dǎo)致了Efb免疫組攻毒后出現(xiàn)比ClfA免疫組保護(hù)率低。

本研究的對比結(jié)果表明Efb分子與ClfA一樣，也具有良好的免疫原性和較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，因此本研究結(jié)果提示Efb具有很好的潛力作為金黃色葡萄球菌疫苗的候選分子。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Immunological comparison of Efb and ClfA ofisolated from bovine

Yuntao Liu1, Yan Su1, Baojiang Zhang1, Lingling Su2, and Huijiao Jiang1

1College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang,China 2Feed Research Institute, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830000, Xinjiang, China

To compare immunological characteristics of Extracellular fibrinogen-binding protein (Efb) and Clumping factor A (ClfA) of, we constructed two prokaryotic expression vector pET28a-Efb and pET28a-ClfA. After prokaryotical expression and purification, Efb and ClfA were used to immunize experimental animal. After the second immunization the antisera were collected and the antibody titers, the bacteria binding activity and adhesion inhibition activity of these antisera were detected by enzyme linked immunosorbent assay, adhesion inhibition assay and challenge. Both Efb and ClfA had Fibrinogen binding activity whereas the former had better Fibronectin binding activity. The bacteria binding capability of antisera of rabbits immunized with ClfA was better than that with Efb (<0.01). Both antisera of Efb and ClfA could inhibit adherence activity ofto Fibrinogen and Fibronectin adherence compare to the control group (<0.01), and Efb had better adhesion inhibition activity than ClfA. The antibody titer of immunized group could reach 1:40 500. After the second immunization, both Efb and ClfA had good protective efficacy. This result constitutes a good foundation forsubunit vaccine development.

, ClfA, Efb, immunological characteristics

10.13345/j.cjb.140582

November 25, 2014; Accepted:January 21, 2015

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31260222, 31160191), High Technologies Research Program of Xinjiang (No. 201311108), Research Fund for Basic Veterinary of Higher Education of Xinjiang.

Yan Su. Tel: +86-991-8762704; E-mail: 2006au@163.com

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31260222, 31160191), 新疆維吾爾自治區(qū)高新技術(shù)項(xiàng)目 (No. 201311108), 自治區(qū)普通高校重點(diǎn)學(xué)科基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)科項(xiàng)目資助。