顏光耀，李佩真，任才芳，王鋒，張艷麗

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山羊生殖細(xì)胞特異報告載體pVASA-EGFP的構(gòu)建及表達(dá)

顏光耀*，李佩真*，任才芳，王鋒，張艷麗

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 江蘇省家畜胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095

顏光耀, 李佩真, 任才芳, 等. 山羊生殖細(xì)胞特異報告載體pVASA-EGFP的構(gòu)建及表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2015, 31(9): 1313–1324.Yan GY, Li PZ, Ren CF, et al. Construction of goat germ cell specific reporting system pVASA-EGFP. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1313–1324.

為監(jiān)測成體干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的過程，分析生殖細(xì)胞特異性DEAD-box家族ATP依賴RNA解旋酶在不同日齡山羊睪丸組織中的表達(dá)情況并構(gòu)建山羊生殖細(xì)胞特異性報告載體pVASA-EGFP。通過免疫熒光及RT-PCR法監(jiān)測的表達(dá)情況，利用分子技術(shù)構(gòu)建報告載體pVASA-EGFP，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，經(jīng)過視黃酸 (Retinoic acid，RA) 誘導(dǎo)后，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況以鑒定該報告載體的有效性。免疫熒光結(jié)果顯示，Vasa在性成熟不同階段的山羊睪丸組織中均有表達(dá)，RT-PCR結(jié)果表明基因在3月齡、10月齡山羊睪丸組織中顯著高于10日齡組。測序及酶切鑒定結(jié)果表明，擴(kuò)增的基因啟動子片段成功連至N1載體，轉(zhuǎn)染BMSCs后經(jīng)4 d的RA誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光蛋白表達(dá)，表明成功構(gòu)建了山羊基因啟動子調(diào)控的報告載體pVASA-EGFP。以上結(jié)果表明，基因在不同日齡山羊睪丸組織中均有表達(dá)，所構(gòu)建的山羊生殖細(xì)胞特異性報告載體pVASA-EGFP具有示蹤山羊成體干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程的能力，為下一步監(jiān)測山羊BMSCs向生殖細(xì)胞分化的過程提供了鑒定和篩選方法。

DEAD-box家族ATP依賴RNA解旋酶，啟動子，生殖細(xì)胞，視黃酸，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，山羊

基因是DEAD-box基因家族的重要成員之一[1]，DEAD-box基因家族存在于從細(xì)菌到哺乳動物的許多物種中，因其具有高度保守DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 序列而得名。該蛋白在細(xì)胞、RNA代謝中具有重要作用，參與RNA代謝幾乎所有的過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA前體的剪接、核糖體組裝、核內(nèi)mRNA運(yùn)輸、翻譯起始調(diào)控等。在絕大多數(shù)物種中，基因僅限在生殖細(xì)胞系中特異性表達(dá)，Vasa蛋白對于生殖細(xì)胞的形成和卵子極性的建立以及某些發(fā)育基因的mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控都具有重要作用，因此作為一種分子標(biāo)記物廣泛用于研究配子發(fā)生和原始生殖細(xì)胞 (Primordialgerm cells，PGCs) 起源、遷移、分化等方面[2-4]。

隨著干細(xì)胞的研究手段日益成熟，科學(xué)家逐漸利用胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞作為體外的模型，通過各種誘導(dǎo)方式，從體外獲得了生殖細(xì)胞，從而間接研究生殖細(xì)胞的發(fā)生、遷移和成熟等各個過程[5-9]。但是通過干細(xì)胞體外誘導(dǎo)得到的生殖細(xì)胞，較難分離純化。2009年，Kee等[10]首次構(gòu)建基因啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白 (GFP) 表達(dá)的載體 (pVASA-GFP)，將其轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞 (Human embryonic stem cells，hESC) 后通過誘導(dǎo)，分選出綠色熒光陽性細(xì)胞——PGCs，此方法為研究其他物種生殖細(xì)胞的發(fā)生過程提供了思路。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 是一種最為廣泛運(yùn)用的成體干細(xì)胞，具有易分離純化、易鑒定、體外培養(yǎng)方便等特點(diǎn)，并且避免了胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cells，ESCs) 所涉及的倫理道德等問題[11]。因此BMSCs是體外研究生殖細(xì)胞的理想模型之一。

本試驗(yàn)首先驗(yàn)證了基因在不同日齡山羊睪丸組織中的表達(dá)，然后進(jìn)一步構(gòu)建了基因啟動子驅(qū)動EGFP表達(dá)的載體pVASA-EGFP，將其轉(zhuǎn)染經(jīng)視黃酸 (Retinoic acid，RA) 誘導(dǎo)處理的山羊BMSCs，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，從而驗(yàn)證載體的有效性。本試驗(yàn)初步建立了體外成體干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的模型，并且通過構(gòu)建生殖細(xì)胞特異的報告載體，為后期分離和純化轉(zhuǎn)分化得到的生殖細(xì)胞提供很好的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

山羊睪丸組織由江蘇金盛山羊繁育技術(shù)發(fā)展有限公司提供。載體pEGFP-N1、大腸桿菌DH5α均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎工程技術(shù)中心保存。LA酶、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)品和各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。DNA凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。細(xì)胞RNA提取試劑盒購自天根公司。細(xì)胞基本培養(yǎng)基 (L-DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。引物合成和基因測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光定位不同日齡山羊睪丸組織中Vasa表達(dá)

取10日齡、3月齡和10月齡的山羊睪丸組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋：70%、85%、95%乙醇系列脫水，各1 h，然后100%無水乙醇脫水3次，每次2 h；經(jīng)50%乙醇和50%二甲苯混合液處理30 min后，二甲苯透明2次，每次30 min；經(jīng)50%二甲苯和50%石蠟混合液處理30 min后，放入石蠟中過夜處理；包埋后，對修好的蠟塊進(jìn)行切片，厚度為5mm。山羊睪丸組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)的二甲苯脫蠟及乙醇系列水化后，用3%甲醇-H2O2處理1 h以消除內(nèi)源性過氧化物酶，再經(jīng)檸檬酸三鈉 (pH 6.0) 100 ℃抗原熱修復(fù)處理1 h后，PBS沖洗3次，10%BSA室溫封閉1 h；特異性抗體Vasa (ab13840，工作濃度1∶300) 4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體，在37 ℃下孵育1 h，用PBS洗凈后，經(jīng)DAPI核染，封片觀察。

1.2.2 熒光定量PCR檢測在不同日齡山羊睪丸組織中的表達(dá)特異性

用Trizol試劑提取10日齡、3月齡和10月齡山羊睪丸總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，山羊引物作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR) 檢測的表達(dá)，引物見表1。按照試劑盒 (TaKaRa公司) 的要求在冰上進(jìn)行如下體系混合 (20 μL體系)：H2O 6.8 μL，引物 (10 μmol/L) 各0.4 μL，模板2 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，SYBR Premix Ex10 μL，混勻離心后在熒光定量PCR儀 (Stepone plus，美國ABI公司) 上反應(yīng)檢測，反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束繪制熔解曲線。利用2–△△Ct法對基因在不同日齡山羊睪丸組織中的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.3基因的擴(kuò)增與克隆

根據(jù)已發(fā)表的牛非編碼區(qū)序列 (GenBank Accession No. NR_103807.1)，設(shè)計(jì)合成引物，上下游引物 (-F/R)：5?-GGCAGGAAAGGCGAAGGAG-3?/5?-GCATAACCATCAGGTGGAGAA-3? (下劃線分別為Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn))。利用TIANGEN試劑盒方法提取10月齡山羊睪丸基因組DNA，以-F和-R為引物在普通PCR儀上進(jìn)行反應(yīng) (VERITI PCR，美國ABI公司)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。預(yù)期PCR產(chǎn)物長度應(yīng)為1 044 bp。

1.2.4 pMD-VASA載體構(gòu)建與測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)快速回收和pMD19-T載體在T4 DNA連接酶作用下于16 ℃連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液與IPTG和X-gal按比例混勻后涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平皿上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取大小均勻的白斑菌落，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書小量提取質(zhì)粒，經(jīng)Ⅰ與Ⅰ雙酶切鑒定，將獲得的陽性克隆質(zhì)粒 (命名為pMD-VASA) 送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 pVASA-EGFP報告載體的構(gòu)建

將載體質(zhì)粒pEGFP-N1和測序正確的質(zhì)粒pMD-VASA分別用內(nèi)切酶Ⅰ與Ⅰ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒載體和基因片段，T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)含氨芐青霉素的LB平皿培養(yǎng)篩選克隆、提取質(zhì)粒后，用Ⅰ與Ⅰ雙酶切鑒定，再送公司測序。測序正確的菌株于37 ℃擴(kuò)培，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，命名為pVASA-EGFP，測定其核酸濃度備用。

1.2.6 山羊BMSCs的分離培養(yǎng)與體外RA誘導(dǎo)

將1月齡海門山羊快速放血致死，無菌條件下取股骨和脛骨，剔除附著的肌肉組織，置體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡10 min。用滅菌鋼鉗剪除兩側(cè)骨骺端，再用L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓液于無菌離心管中，1 000 r/min離心20 min，取沉淀，用含有20%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。將5 mL細(xì)胞懸液接種于25 cm2底面積的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待原代細(xì)胞接近90%融合時，用胰酶消化，按1∶3傳代，一部分繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分置于液氮中保存?zhèn)溆?。取?代BMSCs，按2×104個/mL的細(xì)胞密度分別接種于24孔培養(yǎng)板中，對其用濃度為10μmol/L的RA進(jìn)行體外誘導(dǎo)。

1.2.7 RA誘導(dǎo)后BMSCs中基因表達(dá)水平的檢測

對RA誘導(dǎo)4 d后的BMSCs進(jìn)行RT-PCR、免疫熒光檢測。用Trizol試劑提取RA處理4 d后的山羊BMSCs總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，加入引物，以山羊引物作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

對RA誘導(dǎo)4 d后的BMSCs進(jìn)行免疫熒光檢測。第3代經(jīng)RA處理4 d的山羊BMSCs以1×104個/mL接種24孔板，待細(xì)胞95%融合后，以4%多聚甲醛固定30 min，0.1 mol/L PBS洗3遍，用含0.25% Triton-X-100的PBS孵育細(xì)胞30 min，PBS洗滌3遍后，經(jīng)5% BSA封閉1 h，以兔源Vasa多克隆抗體 (ab13840，Abcam) 常溫孵育1 h，用PBS洗滌5次，每次5 min。二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔的多克隆抗體，常溫下孵育1 h，PBS洗滌5次，每次5 min。Olympus FluoViewTM 500激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.8 RA誘導(dǎo)后BMSCs細(xì)胞周期測定

取RA誘導(dǎo)4 d的第3代BMSCs，調(diào)整細(xì)胞含量為5.0×106/mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS洗1遍，離心得到細(xì)胞團(tuán)，加入1 mL DNA染色液，渦旋混合5–10 s，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.9 重組質(zhì)粒pVASA-EGFP導(dǎo)入山羊BMSCs中并進(jìn)行RA誘導(dǎo)

轉(zhuǎn)染前2 d，將BMSCs接種至6孔板中，培養(yǎng)液為含15%胎牛血清，不含青霉素、鏈霉素的L-DMEM。當(dāng)細(xì)胞匯合80%–90%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法將重組質(zhì)粒pVASA-EGFP轉(zhuǎn)染山羊BMSCs。轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液換為含15%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各100 U/mL的L-DMEM。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行RA (濃度為10–6mol/L) 誘導(dǎo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同山羊睪丸組織中Vasa蛋白定位及vasa基因mRNA水平表達(dá)

本試驗(yàn)對于不同日齡山羊睪丸組織進(jìn)行了組織的免疫熒光。發(fā)現(xiàn)Vasa在不同日齡睪丸組織中均有表達(dá)，在10日齡和3月齡的山羊睪丸組織中，Vasa主要在支持細(xì)胞和初級精母細(xì)胞中表達(dá) (圖1A和1B)。在10月齡的山羊睪丸組織中，Vasa在初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和支持細(xì)胞中均有明顯表達(dá) (圖1C)。

本試驗(yàn)進(jìn)一步對基因在不同日齡山羊睪丸組織進(jìn)行mRNA水平的熒光定量RT-PCR檢測。發(fā)現(xiàn)性成熟的山羊睪丸 (3月齡、10月齡) 中的mRNA水平表達(dá)量相對10日齡顯著升高 (>0.05，圖2)，表明在不同性成熟階段山羊睪丸組織中表達(dá)的特異性。

2.2 山羊vasa基因啟動子片段的擴(kuò)增及序列分析

以山羊基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示為單一條帶，大小約為1.0 kb，與預(yù)期大小 (1 044 bp) 基本一致 (圖3A)，切膠回收并送公司測序。克隆片段測序結(jié)果和NCBI上牛的序列比對，同源性為99%。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD-VASA，用Ⅰ與Ⅰ對其進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切后片段大小分別為2 692 bp和1 044 bp，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖3B)。

2.3 pVASA-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將擴(kuò)增的基因序列 (圖3A) 和切掉CMV啟動子的pEGFP-N1部分載體4.1 kb (圖3B，泳道3、4) 連接。重組質(zhì)粒pVASA-EGFP (圖3C) 分別經(jīng)與Ⅰ雙酶切。結(jié)果表明，所插入的基因大小和方向均正確，雙酶切后得到4.1 kb和1 044 bp的條帶，說明pVASA-EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功 (圖4A)。

圖1 免疫熒光檢測Vasa在不同日齡山羊睪丸組織中的表達(dá)

圖2 Vasa在不同日齡山羊睪丸組織中的mRNA表達(dá)水平

2.4 山羊BMSCs的誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定

對第3代山羊BMSCs添加RA (10–6mol/L) 進(jìn)行體外誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 d后的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、RT-PCR、免疫熒光分析。結(jié)果表明，細(xì)胞變圓變大，核質(zhì)比升高 (圖5)，和基因表達(dá)升高 (圖4B)，Vasa蛋白的表達(dá)水平升高 (圖6)。這些結(jié)果表明BMSCs已經(jīng)開始表達(dá)生殖細(xì)胞特異的基因，間接說明體外轉(zhuǎn)分化的開始。另外，本試驗(yàn)還對RA誘導(dǎo)前后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前的山羊BMSCs G1期的含量在85% (圖7A)，而G2期的細(xì)胞含量減少至79% (圖7B)。

圖3 載體構(gòu)建電泳圖

圖4 載體圖譜和RA誘導(dǎo)的PCR鑒定

圖5 RA處理前后細(xì)胞的形態(tài)圖

2.5 pVASA-EGFP重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)后觀察

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pVASA-EGFP轉(zhuǎn)染山羊BMSCs，轉(zhuǎn)染后24 h，進(jìn)行RA的體外誘導(dǎo)。誘導(dǎo)3 d后，在熒光顯微鏡下可觀察到山羊BMSCs表達(dá)綠色熒光蛋白 (圖8)，進(jìn)一步驗(yàn)證了所構(gòu)建報告載體的正確性。試驗(yàn)將山羊成纖維細(xì)胞作為陰性對照，RA誘導(dǎo)后，沒有觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。

圖6 免疫熒光檢測Vasa在經(jīng)RA處理前后的BMSCs中的表達(dá)

圖7 RA處理前后BMSCs細(xì)胞周期變化

3 討論

BMSCs是一群存在于骨髓中具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細(xì)胞，在多個物種中的研究都已經(jīng)證明了該類干細(xì)胞具有體外分化為3個胚層諸多細(xì)胞類型的能力，可見BMSCs在分化潛能上幾乎可以與ESCs相媲美。而且與ES細(xì)胞相比，BMSCs具有取材方便、體外易培養(yǎng)、增殖快和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)。BMSCs這些獨(dú)特的生物學(xué)特性使其可作為生殖細(xì)胞發(fā)育分化、基因表達(dá)調(diào)控的理想研究模型和種子細(xì)胞。因此，本試驗(yàn)在山羊BMSCs的基礎(chǔ)上，構(gòu)建早期生殖細(xì)胞報告系統(tǒng)，對后續(xù)轉(zhuǎn)分化試驗(yàn)提供平臺。

圖8 山羊BMSCs轉(zhuǎn)染pVASA-EGFP報告載體并經(jīng)RA誘導(dǎo)3 d后綠色熒光蛋白表達(dá)情況

在絕大多數(shù)物種中，基因是生殖細(xì)胞系的標(biāo)記分子，這一特點(diǎn)引起了人們對其功能探索的興趣。早在上世紀(jì)80年代，通過對果蠅基因的研究發(fā)現(xiàn)：Vasa蛋白是生殖細(xì)胞的重要組成部分，基因在所有發(fā)育時期的生殖細(xì)胞中表達(dá)，其在生殖細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的作用；雌性基因的突變體可以導(dǎo)致卵子發(fā)生缺陷，產(chǎn)生的卵子雖然能夠受精，但由該受精卵發(fā)育的胚胎缺少生殖細(xì)胞。因此，基因不僅在果蠅成體配子發(fā)生過程中是必需的，在胚胎發(fā)生過程中對生殖細(xì)胞的分化也是至關(guān)重要的[12]。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)：雄性個體基因突變將致使生殖細(xì)胞因不能完成減數(shù)分裂而凋亡，最后導(dǎo)致精子無法生成，而且性腺中PGCs的增殖活性顯著下降。在本試驗(yàn)中通過對性成熟前后不同階段的山羊睪丸組織進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測，亦可發(fā)現(xiàn)在性成熟后的表達(dá)水平顯著上升，可見基因?qū)ι臣?xì)胞的增殖和分化都具有重要作用[13-14]。

基因在多數(shù)物種間具有高度保守的特性，且其表達(dá)在生殖細(xì)胞中具有特異性，因此，國內(nèi)外已有實(shí)驗(yàn)室利用基因進(jìn)行報告載體的構(gòu)建，并用其進(jìn)行生殖細(xì)胞的示蹤和研究。2006年，Okutsu 等[15]通過克隆虹鱒魚的基因啟動子區(qū)域，將其和基因片段相連。通過轉(zhuǎn)基因的方法，該試驗(yàn)團(tuán)隊(duì)分離出了大量的虹鱒魚的原始生殖細(xì)胞。Tsunekawa等[16]克隆了雞的同源基因 (Chicken VASA homolog，CVH)，構(gòu)建的特異啟動子，成功對雞的原始生殖細(xì)胞進(jìn)行了定位，為研究雞PGCs的發(fā)生機(jī)理和遷移過程提供方法和途徑。利用類似的方法，2008年，F(xiàn)an等[17]通過將斑馬魚的基因啟動子和(紅色熒光蛋白) 基因相連，利用轉(zhuǎn)基因的方法篩選得到原始生殖細(xì)胞。此前基因的研究和應(yīng)用大多集中于兩棲動物中，2009年，Kee等[10]首次構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白報告基因和生殖細(xì)胞特異性基因(VASA-GFP) 的重組質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染hESC，通過誘導(dǎo)，分選表達(dá)基因的早期生殖細(xì)胞。

RA是維生素A (VA) 的生物活性代謝物，很多研究表明RA是在哺乳動物減數(shù)分裂的起始階段發(fā)揮重要作用[18]。近年來，許多學(xué)者將RA作為小鼠性腺減數(shù)分裂誘導(dǎo)因子，在雌性小鼠上，RA啟動受精12.5 d的PGCs發(fā)生減數(shù)分裂進(jìn)行生殖細(xì)胞的發(fā)育分化；在雄性小鼠中，由支持細(xì)胞前體產(chǎn)生的CYP26b1阻止了胎兒期雄性性腺的減數(shù)分裂。RA對雄性生育是必需的，在VA缺乏癥的小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)僅能觀察到未分化的精原細(xì)胞 (As、Apr、Aal型精原細(xì)胞)，注射RA或視黃醇24–48 h后，可以觀察到停滯的Aa1型精原細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期分化為A1型精原細(xì)胞。大量試驗(yàn)證明，長期用RA或視黃醇代替VA來飼養(yǎng)VA缺乏的小鼠或大鼠，會促使一些精子細(xì)胞的發(fā)生。鑒于RA對生殖細(xì)胞不可或缺的作用和生殖細(xì)胞體內(nèi)難以獲取的特性，有實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過RA在體外對ES細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，體外誘導(dǎo)獲取生殖細(xì)胞，從而研究生殖細(xì)胞的發(fā)生過程。Kerkis等[19]用RA誘導(dǎo)雄鼠的ESC，經(jīng)類胚體 (Embryonic body，EB) 分化為精子和卵子，細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記，將誘導(dǎo)的精卵共培養(yǎng)能形成受精卵并最終發(fā)育為桑葚胚、胚泡樣結(jié)構(gòu)。雖然ES細(xì)胞已逐漸成為體外研究生殖細(xì)胞的很好的模型，但ES細(xì)胞由于倫理道德等問題的限制，研究者已經(jīng)嘗試在成體干細(xì)胞上進(jìn)行深一步的探索。2006年，Nayernia等[20]通過RA在體外對小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，和本文異曲同工之處在于報告載體的運(yùn)用。該小組通過驅(qū)動的報告載體篩選表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，即體外獲得的生殖樣細(xì)胞。通過分選，將體外誘導(dǎo)后的生殖樣細(xì)胞進(jìn)行純化并鑒定。通過PCR和免疫熒光發(fā)現(xiàn)RA誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)原始生殖細(xì)胞和精原干細(xì)胞的表面標(biāo)記、、、、、、、、、、、、和，但是并沒有通過RA誘導(dǎo)在體外得到減數(shù)分裂后期的生殖細(xì)胞。2009年，Hua等[5]報道人類的BMSCs在體外通過RA和睪酮的誘導(dǎo)，也可以使誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)減數(shù)分裂前期和后期的幾乎所有分子標(biāo)記。除了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人臍帶中也可以分離得到成體干細(xì)胞。Huang等[21]證實(shí)，人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs) 在全反式維甲酸、睪酮及睪丸細(xì)胞條件培養(yǎng)基下誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞，HUMSCs形成的“蝌蚪樣”細(xì)胞顯示生殖細(xì)胞特異標(biāo)記物Oct4 (pouf5)、C-kit、CD49 (falpha-6)、Stella (DDPA3) 和Vasa等蛋白表達(dá)。

本試驗(yàn)首先檢測了基因在山羊體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果表明基因在不同日齡的山羊睪丸組織中均有表達(dá)，且主要分布在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中。熒光定量PCR說明，在性成熟睪丸組織中的表達(dá)較高。這些結(jié)果和之前報道相一致[2]。且有報道也表明，敲除會影響生殖細(xì)胞的發(fā)育[8]。這些結(jié)果提示：基因在生殖細(xì)胞體內(nèi)生長發(fā)育過程中可能起著重要的作用。另外，本試驗(yàn)還初步建立了山羊BMSCs向早期生殖細(xì)胞分化的體外模型。通過RA的體外誘導(dǎo)，細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了變化，且表達(dá)了、和等生殖細(xì)胞特異的分子標(biāo)記。這些結(jié)果間接說明：RA能夠在體外誘導(dǎo)山羊BMSCs向早期生殖細(xì)胞分化。

我們將構(gòu)建的pVASA-GFP生殖細(xì)胞報告載體轉(zhuǎn)染經(jīng)RA誘導(dǎo)處理的山羊BMSCs后，可以觀察到熒光的表達(dá)，但是熒光強(qiáng)度和陽性率不高，這可能是因?yàn)闊晒獗磉_(dá)驗(yàn)證是在RA體外誘導(dǎo)4 d后觀察的，且載體是瞬時轉(zhuǎn)染。因此如果進(jìn)一步優(yōu)化RA體外誘導(dǎo)時間或進(jìn)行載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可能可以提高綠色熒光的表達(dá)。另外，由于沒有完整地克隆出山羊基因啟動子全部序列，有可能在未克隆的5'非編碼區(qū)域存在其他重要的啟動子元件，這些元件可能為成功啟動后續(xù)基因表達(dá)有著重要作用。但本試驗(yàn)中綠色熒光的順利表達(dá)說明報告載體的正確性。

從體外分化得到生殖細(xì)胞樣細(xì)胞已成為研究生殖細(xì)胞發(fā)育機(jī)制的新方法，目前已有文獻(xiàn)報道從胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化得到減數(shù)分裂后期的生殖細(xì)胞，但是目前還沒有報道成體干細(xì)胞直接體外分化得到單倍體生殖細(xì)胞。本試驗(yàn)成功構(gòu)建的山羊生殖細(xì)胞特異報告載體pVASA-EGFP，為下一步體外誘導(dǎo)山羊BMSCs分化為生殖細(xì)胞提供了很好的鑒定和純化的平臺。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction of goat germ cell specific reporting system pVASA-EGFP

Guangyao Yan*, Peizhen Li*, Caifang Ren, Feng Wang, and Yanli Zhang

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

To monitor the trans-differentiation from adult stem cells to germ cells, we analyzed theexpression of goat testicular tissues in different ages and constructed the germ cell specific reporting vector pVASA-EGFP. The expression ofwas verified by RT-PCR and immunofluorescence. The vector pVASA-EGFP was constructed by molecular technology, then transfected into goat bone mesenchymal stem cells (BMSCs) by Lipofectamine 2000. Moreover, we observed the expression of the vector through green fluorescent protein (GFP). Immunofluorescence results show that Vasa was expressed in all groups of goat testicular tissues, RT-PCR results show that the levels ofmRNA in 3-month group and 10-month group were significantly higher than that in 10-day group. Sequencing and restriction enzyme results show that the vector was successfully constructed. After transfection and RA treatment, GFP expression was observed, which proved the validity of our reporting system. All the results proved thatwas expressed in different ages in goat testicular tissues, and the vector pVASA-EGFP is efficient in monitoring the trans-differentiation, which paves the way for further characterization and screening of the trans-differentiation of goat BMSCs.

DEAD-box protein family of RNA helicases, promoter, germ cell, retinoic acid, bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), goat

10.13345/j.cjb.140623

December 15, 2014; Accepted:April 15, 2015

National Natural Science Foundation of China (No. 31201802), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. KYZ201211), PhD Program Foundation of the Ministry of Education of China (No. 20120097120038).

Feng Wang. Tel:+86-25-84395381; E-mail: caeet@njau.edu.cn Yanli Zhang. Tel:+86-25-84395381; E-mail:zhangyanli@njau.edu.cn

*These authors contributed equally to this study.

國家自然科學(xué)基金 (No. 31201802)，中央高?；究蒲谢?(No.KYZ201211)，國家教育部博士點(diǎn)基金 (No.20120097120038) 資助。

2015-05-25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150525.1038.001.html