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不同血型個(gè)體混合細(xì)胞的免疫標(biāo)識(shí)及DNA檢驗(yàn)

王清山1，2，李學(xué)博1，李紅衛(wèi)1，2

（1.山東政法學(xué)院山東省高校證據(jù)鑒識(shí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014；2.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶400021）

摘要:目的應(yīng)用免疫技術(shù)標(biāo)識(shí)不同ABO血型個(gè)體的上皮細(xì)胞，建立混合物證分離檢驗(yàn)鑒定方法。方法取正常人體口腔上皮細(xì)胞，制備不同血型個(gè)體的混合口腔上皮細(xì)胞，經(jīng)免疫組化染色，根據(jù)細(xì)胞膜的呈色差異，利用激光捕獲顯微切割目的細(xì)胞5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)，所獲樣本進(jìn)行多位點(diǎn)低體積復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3130XL型DNA測(cè)序儀檢測(cè)，GeneMapper ID software vs. 3.2軟件分析，以獲得13個(gè)以上STR分型為有效分型（各等位基因峰高大于50RFU）。結(jié)果根據(jù)免疫組化結(jié)果，可對(duì)ABO血型個(gè)體的混合細(xì)胞中的某單一血型細(xì)胞進(jìn)行分離檢驗(yàn)。DNA有效分型檢出率隨著切割回收細(xì)胞數(shù)的增加而提高，切割20個(gè)細(xì)胞時(shí)樣本的DNA檢出率達(dá)到90%以上。結(jié)論利用免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)可以分離不同ABO血型個(gè)體的上皮細(xì)胞，對(duì)混合樣本的分離檢驗(yàn)有重要價(jià)值。

關(guān)鍵詞:法醫(yī)遺傳學(xué)；混合細(xì)胞；DNA；STR

混合細(xì)胞物證是較為常見(jiàn)的法醫(yī)學(xué)生物檢材，常見(jiàn)的為乳頭拭子、陰莖拭子、飲料瓶口、煙蒂等，此類(lèi)物證用常規(guī)方法提取和擴(kuò)增，得到的結(jié)果多為混合圖譜，達(dá)不到同一認(rèn)定的要求。法醫(yī)學(xué)工作者對(duì)混合圖譜采取了多種分析方法，如鐘擺系統(tǒng)法[1]、最小二乘法[2]、PE法[3]、峰面積分析法[4]及線性分析法[5]等，但圖譜拆分操作復(fù)雜，且獲得的結(jié)果難以確定某一個(gè)體的DNA分型，導(dǎo)致嫌疑人認(rèn)定困難。A、B抗原不僅存在于紅細(xì)胞膜上，也不同程度的分布在其他細(xì)胞表面和體液內(nèi)，口腔上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種組織細(xì)胞存在ABH物質(zhì)已被研究人員所熟知，甚至腐敗、自溶的組織內(nèi)亦可檢測(cè)出來(lái)。本研究應(yīng)用免疫技術(shù)標(biāo)識(shí)不同ABO血型個(gè)體膜抗原的細(xì)胞，結(jié)合激光顯微切割技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了不同血型混合細(xì)胞的細(xì)胞分離檢驗(yàn)的效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

（1）實(shí)驗(yàn)用口腔上皮細(xì)胞：在知情同意的原則下，由本實(shí)驗(yàn)室30名成年志愿者（A、B、O血型個(gè)體各10名）提供口腔上皮細(xì)胞。漱口后用壓舌板刮取口腔上皮細(xì)胞，PBS洗滌3次，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，稀釋并配制成含有口腔上皮細(xì)胞104/mL個(gè)左右的懸液，4℃保存。另取志愿者的血樣進(jìn)行血型及STR分型檢驗(yàn)。

（2）Anti-Blood Group A Antigen antibody（美國(guó)Abcam公司）。

（3）Anti-Blood Group B Antigen antibody（美國(guó)Abcam公司）。

（4）goat anti-mouse IgG-HRP（英國(guó)Abcam公司）。

（5）DAB顯色試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

（6）PCR反應(yīng)液：ID-plus試劑盒，ABI. （7）高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf）。

（8）電熱恒溫箱（精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。（9）顯微激光切割儀（德國(guó)ZEISS）。（10）低體積擴(kuò)增系統(tǒng)（德國(guó)Advalytix AG）。（11）3130XL型遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）。

1.2方法

1.2.1 A、B抗原的穩(wěn)定性及抗體特異性檢驗(yàn)

（1）分別取上述制備好的上皮細(xì)胞懸液（4℃保存1 d及7 d）0.3 mL涂于粘附載玻片上，置于電熱恒溫箱內(nèi)37℃烤干。

（2）將載玻片置于1% Triton-100溶液內(nèi)透明15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。

（3）將載玻片放入檸檬酸鹽溶液中置于微波爐中煮沸15 min，取出置于室溫待載玻片恢復(fù)到室溫后用PBS洗滌3次，每次5 min。

（4）滴加0.5 mL山羊血清于載玻片細(xì)胞斑跡處，封閉15 min。向各組載玻片上分別滴加抗A抗體、抗B抗體及PBS緩沖液。37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min。

（5）加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，電熱恒溫箱內(nèi)37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min。

（6）DAB染色2 min，去離子水洗滌1次。將載玻片放入蘇木精染液中3 min，90%、100%酒精各1 min，晾干載玻片，顯微鏡下觀察。

1.2.2不同血型混合口腔上皮細(xì)胞的免疫標(biāo)識(shí)及DNA分離檢驗(yàn)

（1）混合口腔上皮細(xì)胞的制備

取0.2 mL已知不同血型個(gè)體的口腔上皮細(xì)胞兩兩混合，制成A/B、A/O、B/O混合上皮細(xì)胞懸液各10份。

（2）不同血型混合口腔上皮細(xì)胞的免疫標(biāo)識(shí)

①分別取上述制備的各組混合上皮細(xì)胞懸液0.4mL涂于粘附載玻片上，置于電熱恒溫箱內(nèi)37℃烤干；

②、③操作同1.2.1步驟（2）、（3）。

④滴加0.5mL山羊血清于載玻片細(xì)胞斑跡處，封閉15min。向各組中分別加入抗A抗體、抗B抗體。37℃孵育1h。PBS洗滌3次，每次5 min。

⑤、⑥操作同1.2.1步驟（5）、（6）。

（3）不同血型個(gè)體混合細(xì)胞的顯微激光切割捕獲。

打開(kāi)顯微激光切割捕獲儀操作軟件，先在空白處聚焦，切割空白處，以檢驗(yàn)激光強(qiáng)度、校正切割面積、切割次數(shù)。對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞膜呈棕色的細(xì)胞及未染棕色的細(xì)胞，分別切割回收5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)。1.2.3 PCR-STR檢驗(yàn)

志愿者血樣用Chelex-100法提取DNA，應(yīng)用Identifiler試劑盒及DNA TYPERR○21熒光復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切割回收的細(xì)胞利用低體積擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行Identifiler多位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增（重復(fù)擴(kuò)增3次），擴(kuò)增產(chǎn)物用3130XL型遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，應(yīng)用GeneMapper ID software vs. 3.2軟件分析。

以等位基因峰高大于50RFU，同一基因座出現(xiàn)該等位基因3次以上為有效數(shù)據(jù)，獲得13個(gè)以上基因座正確分型為有效分型。STR正確分型檢出率=有效分型次數(shù)/重復(fù)次數(shù)；等位基因丟失率=等位基因丟失條帶總數(shù)/預(yù)計(jì)等位基因總條帶；非特異擴(kuò)增=出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的基因座/（16×重復(fù)次數(shù)）。

2　結(jié)果

（1）按上述1.2.1操作步驟染色后，在顯微鏡隨機(jī)視野內(nèi)可見(jiàn)4℃保存1 d及7 d的口腔上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，已知血型的口腔上皮細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合后，鏡下見(jiàn)核呈藍(lán)色，細(xì)胞膜呈棕色；與其他抗體或PBS反應(yīng)后，鏡下見(jiàn)核呈藍(lán)色，細(xì)胞膜未染色（見(jiàn)圖1）。

（2）A/B、A/O、B/A、B/O四組混合口腔上皮細(xì)胞，分別加抗A、抗A、抗B、抗B抗體，按上述1.2.2操作步驟染色后，在隨機(jī)視野內(nèi)可見(jiàn)口腔上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核呈藍(lán)色，部分上皮細(xì)胞膜呈棕色，部分上皮細(xì)胞膜未染成棕色（見(jiàn)圖2）。

圖1　口腔上皮細(xì)胞（4℃保存7d）免疫組化染色情況

圖2　A型、B型混合上皮細(xì)胞（4℃保存7d）加抗A抗體

（3）激光捕獲顯微切割后經(jīng)Lv-PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)顯示：各組棕色細(xì)胞DNA分型與該血型志愿者的分型相同。不同血型個(gè)體的細(xì)胞在5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)細(xì)胞數(shù)量的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著回收細(xì)胞數(shù)量的增多，STR正確分型檢出率明顯提高，等位基因丟失率及非特異擴(kuò)增率也相應(yīng)降低，10個(gè)細(xì)胞樣本組的檢出率達(dá)80%以上，20個(gè)細(xì)胞樣本組的有效檢出率達(dá)90%以上。經(jīng)X2檢驗(yàn)，P＜0.05，說(shuō)明不同細(xì)胞個(gè)數(shù)的DNA有效檢出率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果（見(jiàn)表1）。

3　討論

混合生物檢材的DNA檢驗(yàn)是法醫(yī)檢案的難題之一，近年來(lái)單細(xì)胞分離技術(shù)為混合樣本檢驗(yàn)提供了新的解決方案，有學(xué)者將熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）用于法醫(yī)混合生物樣品的檢驗(yàn)，但該方法只局限于男女混合細(xì)胞的分離檢驗(yàn)，且熒光原位雜交技術(shù)的反應(yīng)條件對(duì)混合樣本有一定的要求，輕微污染及陳舊的混合斑樣本都可能導(dǎo)致檢驗(yàn)失敗[6-9]。

ABO血型系統(tǒng)是人類(lèi)的重要遺傳標(biāo)記及最常用的血型分類(lèi)方法之一，可將人群分為A型、B型、AB型和O型4個(gè)群體，在人群中分別占有一定的比例，并遵循遺傳學(xué)規(guī)律遺傳給后代。利用A、B抗原的存在情況可對(duì)不同血型個(gè)體來(lái)源的上皮細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，這為混合細(xì)胞的特定分離及DNA檢驗(yàn)提供了重要思路。本研究對(duì)4℃保存1 d及7 d的口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜呈棕色，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)上皮細(xì)胞膜AB物質(zhì)是穩(wěn)定存在的。LCM技術(shù)在國(guó)內(nèi)外法醫(yī)DNA檢測(cè)中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，如在混合斑精子細(xì)胞分離、流產(chǎn)組織中胎兒成分分離以及口腔細(xì)胞的分離檢驗(yàn)中獲得了良好效果[10-12]。本研究將免疫標(biāo)識(shí)與LCM技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了不同血型口腔上皮細(xì)胞切割分離的目標(biāo)，同時(shí)應(yīng)用低體積擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行熒光復(fù)合擴(kuò)增，檢驗(yàn)靈敏度大大提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，捕獲5個(gè)細(xì)胞即可得到完整的DNA分型，隨著細(xì)胞數(shù)目的增多，有效檢出率逐漸提高而等位基因丟失率逐漸降低，當(dāng)捕獲細(xì)胞數(shù)為20個(gè)時(shí)樣本的有效檢出率達(dá)90 %以上。亓冰等[13]應(yīng)用單細(xì)胞顯微捕獲技術(shù)聯(lián)合Lv-PCR系統(tǒng)的研究表明，捕獲3個(gè)細(xì)胞即可獲得完整的DNA分型，1個(gè)細(xì)胞的檢出率亦可達(dá)到43.3%。本實(shí)驗(yàn)的靈敏度相比之較低，分析原因可能是在捕獲前對(duì)細(xì)胞和涂片做了一些處理，可能會(huì)造成某些細(xì)胞核膜破裂，導(dǎo)致染色體丟失無(wú)法檢測(cè)之故，相關(guān)研究中也報(bào)道了這一結(jié)果[14]。

表1　切割回收不同細(xì)胞個(gè)數(shù)樣本組DNA分型情況

本研究運(yùn)用的免疫組化方法比免疫熒光染色對(duì)樣本的要求更低，可以對(duì)不同血型個(gè)體的細(xì)胞進(jìn)行了有效區(qū)分，LCM切割回收20個(gè)細(xì)胞即可獲得滿足需求的STR分型，對(duì)實(shí)際檢案具有重要意義。在今后的研究中，如何區(qū)分A/AB型、B/AB型混合的口腔上皮細(xì)胞，如何將該技術(shù)擴(kuò)展到混合精液、混合血等混合樣本的分離檢驗(yàn)，是我們要不斷努力攻克的方向。

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（本文編輯：李成濤）

鑒定制度

Forensic System

E-mail:cqlhw2013@126.com。

Separation of Mixed Cell Samples of Different Blood Groups by Immuno-labelling and DNA Typing

WANG Qing-shan1，2，LI Xue-bo1，LI Hong-wei1，2

(1.Shandong University of Political Science and Law，Key Laboratory of Evidence Identification in Colleges and Universities of Shandong Province，Jinan 250014，China; 2.Institute of Forensic Science，Chongqing Public Security Bureau，Chongqing 400021，China)

Abstract:Objective To establish a new method for separating mixed epithelial cell mixtures from individuals of different ABO blood groups by immunological method. Method Mixed oral epithelial cell samples from individuals of different ABO blood groups were prepared. The cells were distinguished by immunohistochemical staining method. Three groups of samples which contained 5，10 and 20 oral epithelial cells were captured respectively by laser capture micro-dissection. All the samples were then amplified by low volume amplification techniques. The PCR products were separated and analyzed with a 3130XL genetic analyzer and GeneMapper ID software version 3.2. The number of correctly amplified gene loci was calculated. Results The cells of a single blood group can be separated from the mixture by the established method. The detection rate of DNA typing increased with the number of oral epithelial cells. When 20 oral epithelial cells were captured and amplified，the rate of detection reached 90%. Conclusion Immunohistochemical staining method is effective for separating the mixed samples from individuals of different ABO blood groups and can be utilized in forensic practice.

Key words:forensic genetics; mixed cells; DNA; STR

通信作者：李紅衛(wèi)（1969—），男，主任法醫(yī)師，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)學(xué)檢案、科研及教學(xué)等研究工作。

作者簡(jiǎn)介：王清山（1981—），男，主檢法醫(yī)師，碩士，主要從事DNA檢驗(yàn)鑒定、法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)勘查工作。E-mail: wqshan105@163.com。

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2014HQ018）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（KF1510）；山東省高校證據(jù)鑒識(shí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（山東政法學(xué)院）開(kāi)放課題（KFKT-201401）；重慶市公安局科技攻關(guān)項(xiàng)目（G2014-10）

收稿日期：2015-06-26

文章編號(hào)：1671-2072-（2015）05-0044-04

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2015.05.008

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):DF795.4