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多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)
40%非緩沖甲醛固定組織中的降解DNA

柳燕，李莉，林源，趙珍敏

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

摘要：目的利用多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)檢測(cè)40 %非緩沖甲醛固定組織中降解DNA的SNP位點(diǎn)，提高微量降解檢材DNA的檢測(cè)時(shí)限，評(píng)估法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能。方法提取保存在非緩沖40 %甲醛溶液中不同天數(shù)的人體組織DNA，用MALDI-TOF MS技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)自行設(shè)計(jì)的67個(gè)X-SNP位點(diǎn)。STR和miniSTR位點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)限評(píng)估用AmpFSTR identifiler和AmpFSTR MiniFiler試劑盒完成。結(jié)果40%非緩沖甲醛固定組織的STR和miniSTR位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)限分別為7 d和15 d；用MALDI-TOF MS技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)67個(gè)X-SNP位點(diǎn)，檢測(cè)片段均小于105bp，其中44個(gè)獨(dú)立遺傳X-SNP位點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)限可達(dá)44d。結(jié)論MALDITOF MS技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)X-SNP位點(diǎn)可明顯提高降解DNA樣本的檢測(cè)能力。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；單核苷酸多態(tài)性；降解DNA；非緩沖甲醛固定液；聚合酶鏈反應(yīng)；飛行質(zhì)譜技術(shù)

眾所周知，甲醛在空氣中逐漸被氧化呈現(xiàn)的酸性環(huán)境對(duì)DNA雙鏈有著極強(qiáng)烈的破壞性，40 %非緩沖甲醛固定組織中的DNA片段會(huì)隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸脆性增加被降解。DNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度逐漸下降，其降解程度直接影響法醫(yī)DNA的分型檢測(cè)成功率。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)是新近發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)單而高效的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，其主要用途之一就是可以對(duì)基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析。本文在多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)上，以X-SNP作為檢測(cè)標(biāo)記，嘗試檢測(cè)超過(guò)STR檢測(cè)時(shí)限的40 %非緩沖甲醛固定組織，以期提高法醫(yī)實(shí)踐中極度降解DNA的檢測(cè)成功率。

1　材料與方法

1.1樣品和DNA提取

操作：在40 %甲醛溶液中固定保存了不同天數(shù)（4、7、15、37、44 d）的人體器官組織（心、腦、肝、脾、腎、肺、胃、腸），用蒸餾水淋洗干凈后，按QIAGEN公司“QIAamp DNA mini試劑盒”提取DNA。

1.2常染色體STR基因座分型

采用Identifiler和MiniFiler試劑盒在3100XL遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）上對(duì)DNA提取液分別進(jìn)行15個(gè)STR和9個(gè)miniSTR的片段分型檢測(cè)，觀察經(jīng)不同時(shí)間40 %非緩沖甲醛固定液固定后人體組織的可檢測(cè)STR基因座，分析DNA片段降解情況。

1.3 SNP位點(diǎn)的選擇

參考文獻(xiàn)按[1]合成67個(gè)X-SNP位點(diǎn)的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 SNP分型

所有反應(yīng)均在9700擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行，以水代替模板作為陰性對(duì)照。

1.4.1多重復(fù)合PCR

67個(gè)SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列分別由3個(gè)17重和1 個(gè)16重共計(jì)4組復(fù)合PCR反應(yīng)完成。擴(kuò)增體系為5 μL，包含10×PCR緩沖液0.625μL、2.5mmol/L dNTP 1μL、25mmol/L MgCl20.325μL、引物1μL、純水0.95μL、10 ng/μL DNA 1 μL、5 U/μL熱啟動(dòng)Taq酶0.1 μL。PCR條件為94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1min，45次循環(huán)；72℃3min。

1.4.2蝦堿性磷酸酶反應(yīng)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶處理，去除多余dNTP。反應(yīng)體系組成為：1 U/μL SAP 0.3μL、10×SAP緩沖液0.17μL、純水1.53μL，保溫37℃40min、85℃15min。

1.4.3單堿基引物延伸反應(yīng)

單堿基引物延伸反應(yīng)體積為2 μL，包含10×iPlex緩沖液0.2 μL，iPlex終止反應(yīng)液0.1 μL，iPlex酶0.0205μL，純水0.7395μL，0.94μL延伸引物。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30s；52℃5s，80℃5s，5次循環(huán)；94℃5s，52℃5 s，80℃5 s，40次循環(huán)；72℃3 min。延伸產(chǎn)物用陽(yáng)離子交換樹脂去鹽純化。

1.4.4基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

用384微孔板（美國(guó)西格諾公司）的自動(dòng)點(diǎn)樣器將待測(cè)樣品點(diǎn)至MassARRAY光譜檢測(cè)芯片上，推入檢測(cè)室進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)質(zhì)量范圍設(shè)定為3920～12023道爾頓，SNP位點(diǎn)的分型用MassARRAY TYPER分析軟件（version 4.0)完成。

2　結(jié)果

2.1 40 %非緩沖甲醛溶液中固定組織的STR檢測(cè)時(shí)限

在40 %甲醛溶液中固定7 d后，用AmpFSTR identifiler試劑盒檢測(cè)的常染色體STR開始降解而不能獲得完整圖譜信息；固定15d后，用MiniFiler kit檢測(cè)的mini STR開始降解而不能獲得完整圖譜信息。固定37~44d后，無(wú)法獲得有用的STR信息。

2.2 40%甲醛溶液中固定組織的SNP檢測(cè)時(shí)限40%非緩沖甲醛固定組織的SNP檢測(cè)時(shí)限隨著組織在固定劑中固定時(shí)間的延長(zhǎng)，越來(lái)越多的SNP位點(diǎn)發(fā)生堿基的錯(cuò)檢或漏檢。固定15 d后，1個(gè)位點(diǎn)（rs5926442）出現(xiàn)錯(cuò)檢；固定37d后，4個(gè)位點(diǎn)（rs5926442，rs1229078，rs12840669，rs2214174）出現(xiàn)錯(cuò)檢；固定44d后，12個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)錯(cuò)檢（見(jiàn)表1）。

表1　發(fā)生錯(cuò)誤分型的SNP位點(diǎn)在被檢測(cè)組織中的發(fā)生時(shí)間?。╠）

續(xù)表1

3　討論

非緩沖甲醛固定劑在室溫下極容易被氧化成甲酸，后者修飾和破壞人體組織DNA，導(dǎo)致DNA提取困難、脆性增加和斷裂降解及PCR抑制作用。隨著組織在福爾馬林液中固定時(shí)間的延長(zhǎng)，其DNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度逐漸下降。因此組織在非緩沖福爾馬林中的固定時(shí)間是影響DNA檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵因素。

AmpFSTR identifiler和AmpFSTR MiniFiler kit是美國(guó)AB公司研發(fā)的在使用比較普遍STR擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，前者DNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度要達(dá)到350 bp，后者DNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一般要達(dá)到250 bp。40 %非緩沖甲醛固定劑固定在4 d以內(nèi)的各種人體組織DNA片段長(zhǎng)度均能達(dá)到350 bp以上，用AmpFSTR identifiler試劑盒可檢測(cè)到全部STR位點(diǎn)。超過(guò)4d后，對(duì)40%非緩沖甲醛固定劑抗性較差的肝、腸等組織DNA片段開始由長(zhǎng)片段到小片段降解，固定9 d后，STR位點(diǎn)檢出率僅為50%[3]。在15d以內(nèi)的福爾馬林固定時(shí)間下，各種人體組織的DNA片段長(zhǎng)度能達(dá)到200 bp以上，對(duì)降解檢材而言，此時(shí)的miniSTR檢測(cè)可以對(duì)常規(guī)STR檢測(cè)起到很好的補(bǔ)充作用。超過(guò)此檢測(cè)時(shí)限，miniSTR的檢測(cè)位點(diǎn)也發(fā)生信息大量丟失的情況。所以，要解決非緩沖福爾馬林固定組織中高度降解DNA的檢測(cè)成功率需要開發(fā)更多片段長(zhǎng)度更短小的檢測(cè)系統(tǒng)。

本研究中采用的X-SNP分型技術(shù)平臺(tái)是多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異性單堿基延伸引物，獲得小于105 bp的DNA擴(kuò)增片段，適合應(yīng)用于超過(guò)miniSTR檢測(cè)時(shí)限、高度降解的小片段DNA分型檢測(cè)。在40%非緩沖甲醛固定劑中固定15 d后，所選擇的67個(gè)SNP位點(diǎn)，除rs5926442以外，均可得到正確分型結(jié)果，rs5926442位點(diǎn)從組織固定15 d后就在心、肝、脾、腎、腸樣品中發(fā)生了T堿基的漏檢，分型從雜合子CT被錯(cuò)檢成C，該位點(diǎn)對(duì)樣品質(zhì)量的要求高于其他位點(diǎn)。其他位點(diǎn)對(duì)40 %非緩沖甲醛固定組織的正確分型力則隨著組織固定時(shí)間的延長(zhǎng)有規(guī)律地減少。當(dāng)固定時(shí)間超過(guò)37 d，可觀察到肝、腸組織又有3個(gè)位點(diǎn)（rs1229078，rs12840669、rs2214174）發(fā)生了錯(cuò)檢或漏檢，至固定44 d，更多組織的其他9個(gè)位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)檢或漏檢。綜合考慮67個(gè)X-SNP在漢族人群中的多態(tài)性分布、在X染色體上的連鎖程度以及各SNP位點(diǎn)在本檢測(cè)平臺(tái)上對(duì)高度降解DNA樣品質(zhì)量的耐受度等，最后確定1個(gè)44X-SNP檢測(cè)系統(tǒng)，其在男性群體和女性群體中的累積個(gè)體識(shí)別率、二聯(lián)體和三聯(lián)體的非父排除率均可達(dá)到法醫(yī)學(xué)實(shí)踐應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)非緩沖福爾馬林固定人體組織的檢測(cè)時(shí)限從miniSTR的15d提高到44d。

[1]Li Li，Yan Liu，Yuan Lin. Typing of 67 SNP Loci on X Chromosome by PCR and MALDI-TOF MS[J]. Research in Genetics 2015，（10）：27-35.

[2]李莉，柳燕，林源，等. 67個(gè)X-SNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)和連鎖不平衡檢驗(yàn)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（5）：337-341.

[3]柳燕，李莉，趙珍敏，等.人體組織在非緩沖福爾馬林固定劑中的STR檢測(cè)時(shí)限[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（1）：1-5.

（本文編輯：李成濤）

鑒定制度

Forensic System

X-SNP Typing of Degraded DNA from Formalin-fixed Tissues by MALDI-TOF MS

LIU Yan，LI Li，LIN Yuan，ZHAO Zhen-min

（Shanghai Key Laboratory of Forensic Science，Institute of Forensic Sciences，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China）

Abstract:Objective To develop an applicable，high resolution X-SNP typing method for extremely degraded DNA from unbuffered formalin-fixed human tissues. Method Various tissues (heart，brain，liver，spleen，kidney，lung，stomach and intestine) obtained from autopsy were immersed in unbuffered formalin at room temperatures and sampled at regular intervals. DNA was extracted by the QIAamp kit，the primers were designed by the MassARRAY Assay Design software (Sequenom Inc.). Multiplex PCR was carried out in four amplification reactions and the related polymorphic sites were extended by the allelespecific primer and analyzed by the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS). Meanwhile，STR typing was also carried out by AmpFSTR identifiler and AmpFSTR MiniFiler. Results All the amplicons of 67 X -SNP loci were shorter than 105 bp. Among them，44 showed independent inheritance and high polymorphisms in Chinese Han population. The set of 44 X-SNP could be used to detect badly degraded DNA from tissues preserved in unbuffered formalin in up to 44 day. The combined discrimination power and the combined exclusion probabilities in both trio and duo case were more than 0.9999. STR and mini STR typing were not detectable in tissues that were preserved in unbuffered formalin for over 7 days and 15 days，respectively. Conclusion X-SNP typing with MALDITOF MS is a useful tool for detecting extremely degraded DNA which has shorter PCR amplicon. It can be applied in forensic personal identity and paternity test，especially in sister's kinship or grandmother-daughter's kinship cases in which alleged father is not available.

Key words:forensic genetics; single nucleotide polymorphisms; degraded DNA; unbuffered formalin; PCR; MALID-TOF.

作者簡(jiǎn)介：柳燕（1963—），女，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)鑒定工作。E－mail：Liny@ssfjd.cn。

基金項(xiàng)目：上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助（14DZ2270800）

收稿日期：2015-06-20

文章編號(hào)：1671-2072-（2015）05-0041-03

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2015.05.007

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào)：DF795.4