復(fù)方地黃方對帕金森病左旋多巴毒副反應(yīng)大鼠酪氨酸羥化酶變化的影響

丁宏娟何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海201203)

摘要〔〕目的探討復(fù)方地黃方對帕金森病(PD)左旋多巴(LD)毒副反應(yīng)大鼠酪氨酸羥化酶(TH)變化的影響。方法采用經(jīng)典的6-羥基多巴胺(6-OHDA)腦立體定向注射術(shù)建立PD大鼠模型，進(jìn)一步腹腔注射2 w左旋多巴制備毒副反應(yīng)模型(LD模型)。將成功的LD模型分為LD模型組和復(fù)方地黃方組，同時(shí)納入正常對照組和假手術(shù)組，每組18只，兩組在繼續(xù)給予LD的同時(shí)，復(fù)方地黃方組給予中藥復(fù)方地黃方治療2、4、6 w，并運(yùn)用免疫組化法觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)黑質(zhì)TH的表達(dá)。結(jié)果從同一時(shí)間點(diǎn)來看，LD模型組和復(fù)方地黃方組TH表達(dá)均低于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的正常對照組和假手術(shù)組(P<0.001)，復(fù)方地黃方組TH表達(dá)均高于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的LD模型組，其中治療4、6 w差異顯著(P<0.001)；從不同時(shí)間點(diǎn)來看，隨著治療時(shí)間的延長，LD模型組TH表達(dá)呈不斷減少趨勢，治療6 w與治療2 w比較差異顯著(P<0.01)，復(fù)方地黃方組TH表達(dá)呈不斷增加趨勢，治療6 w與治療4、2 w比較差異均顯著(P<0.001)。結(jié)論復(fù)方地黃方能明顯增加TH的表達(dá)，減少DA神經(jīng)元的死亡，從而減輕LD的毒副反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕復(fù)方地黃方；帕金森病；左旋多巴；酪氨酸羥化酶

中圖分類號〔〕R742.5〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)

通訊作者：何建成(1966-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

第一作者：丁宏娟(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中醫(yī)證候研究。

The dynamic state effects of compound rehmannia prescription on TH of LD rats with Parkinson's disease

DING Hong-Juan,HE Jian-Cheng.

Preclinical Medical College of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

Abstract【】ObjectiveTo approach the dynamic state effect of compound rehmannia prescription on tyrosine hydroxylase(TH) of LD rats with Parkinson's disease(PD).MethodsThe PD model rats were established by stereotoxic injection of 6-OHDA,then injected intraperitoneally Levodopa/benserazide for 2 w.The successful LD models were randomized into LD model and compound rehmannia prescription groups.The expression of TH in substantia nigra was tested by immunohistochemistry in different time about 2,4,6 w.ResultsAt the same time,the expression of TH in LD model and the compound rehmannia prescription groups was lower than that of normal control and sham-operated groups(P<0.001);it was higher in compound rehmannia prescription group than that of LD model group at 4,6 w(P<0.001).From the different time,the expression of TH was gradually decreased in LD model group,and it was significant at 6 week compared with 2 week(P<0.01);but the expression in compound rehmannia prescription group was gradually increased,and it was significant at 6 w compared with 4 and 2 w(P<0.001).ConclusionsCompound rehmannia prescription could obviously increase the expression of TH in substantia nigra of LD rats with PD,and reduce the DA neuron' death,to lighten the toxic and side effects of Levodopa.

【Key words】Compound rehmannia prescription;Parkinson's disease;Tyrosine hydroxylase(TH)

酪氨酸羥化酶(TH)是腦內(nèi)多巴胺(DA)能神經(jīng)元合成特有的限速酶，是黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志，其表達(dá)水平的高低能反映DA能神經(jīng)元的數(shù)量，與DA變化相一致〔1〕。 而帕金森病(PD)病理狀態(tài)下TH含量及活性降低，長期的左旋多巴(LD)治療可抑制TH活性〔2〕。前期的大量研究表明，中藥復(fù)方地黃方在PD的治療及緩解西藥LD引起的毒副反應(yīng)方面有顯著療效〔3〕，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬探討復(fù)方地黃方緩解LD毒副反應(yīng)的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

總之，中國當(dāng)代都市電影對都市背景下人們的身份認(rèn)同危機(jī)進(jìn)行了不同程度的表現(xiàn)，由此，這些影片成為轉(zhuǎn)型期中國社會的表征。

1.1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及條件動(dòng)物：SPF級雄性SD大鼠150只，體重180～200 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SYXK(滬)2004-0005。實(shí)驗(yàn)條件：動(dòng)物飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫(20±2)℃，自動(dòng)光-暗控制(LD12∶12，即07∶00～19∶00 光照，19∶00～07∶00 暗置)，相對濕度60%～65%，動(dòng)物攝食飲水自由。

1.1.2藥物戊巴比妥鈉：上海中西藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；LD干粉、芐絲肼均為美國Sigma公司產(chǎn)品；慶大霉素：上海第一制藥廠產(chǎn)品，0.3 g/支；中藥，復(fù)方地黃方：熟地黃15 g，白芍30 g，鉤藤15 g，珍珠母15 g，丹參20 g，石菖蒲12 g，全蝎2 g等。大鼠每日用量：DB=DA×7/388。

1.1.3試劑6-羥基多巴胺(6-OHDA)、阿撲嗎啡(APO)、抗壞血酸均為美國Sigma公司產(chǎn)品；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子(GDNF)抗體：Santa Cruz公司產(chǎn)品；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(鼠)、抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒：邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4儀器大鼠腦立體定位儀：TOW-3A型、微量進(jìn)樣器(5 μl)；大鼠腦立體定位儀：TOW-3A型，廣東汕頭市教育醫(yī)學(xué)儀器廠；微量進(jìn)樣器(5 μl)：上海第三分析儀器廠；旋渦混合器：XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；分析天平：Sartorius anglytic，910324；秒表：上海秒表廠，926266；石蠟切片機(jī)：CUT4060石蠟切片機(jī)；石蠟包埋機(jī)：YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)；濕盒：邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2模型制備方法采用6-OHDA腦立體定向注射術(shù)建立PD大鼠模型，進(jìn)一步腹腔注射LD，制備LD 大鼠模型。術(shù)前按常規(guī)進(jìn)行行為測試，確認(rèn)無異常旋轉(zhuǎn)行為后，用戊巴比妥鈉(3%的戊巴比妥鈉，50 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨(商品名：新潔爾滅)常規(guī)消毒。無菌條件下，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準(zhǔn)，根據(jù)包新民等〔4〕的大鼠腦立體定位圖譜，確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo)：①前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨，用5 μl微量進(jìn)樣器將6-OHDA(溶于含0.02%維生素C的生理鹽水中，即秤量藥品抗壞血酸0.001 g，溶于生理鹽水5 ml中)注入右側(cè)黑質(zhì)部(以1.0 mm/min速度緩慢進(jìn)針)，3 μl/孔，注射速度為1 μl/min，注射完畢后留針5 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后，用醫(yī)用可吸收明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7 d，待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。

10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7次/min為合格的PD模型。

將成功的PD模型大鼠腹腔注射LD/芐絲肼(50 mg/kg LD和12.5 mg/kg芐絲肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的注射用水中，配成10 mg/ml)，2次/d(分別為上午9時(shí)和下午5時(shí))，連續(xù)2 w，制備LD大鼠。

2 w后誘發(fā)動(dòng)物，具有典型急性心肌梗死(AIM)表現(xiàn)，且APO誘導(dǎo)大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加者，為成功LD模型〔5〕。

1.3分組及給藥

1.3.1分組方法采用區(qū)層隨機(jī)法，將成功的LD大鼠隨機(jī)分為LD模型組、復(fù)方地黃方組(復(fù)方地黃方+LD)，每組18只。另取正常對照組和假手術(shù)組，每組18只。

1.3.2給藥LD模型組大鼠在腹腔注射LD/芐絲肼的基礎(chǔ)上予生理鹽水灌胃；復(fù)方地黃方組大鼠在腹腔注射LD/芐絲肼的基礎(chǔ)上給予復(fù)方地黃方中藥灌胃；正常對照組、假手術(shù)組腹腔注射等量的含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的注射用水的基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃，2 ml/次，1次/d。

1.4TH免疫組化檢測

1.4.1免疫組化取材及樣品制備各組大鼠測試完畢后，每組不同時(shí)間點(diǎn)(2、4、6 w)各取6只動(dòng)物按3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，進(jìn)行心臟灌注和取樣。(1)先將灌注針頭由左心室心尖部插入升主動(dòng)脈，剪開右心耳。(2)先灌注生理鹽水500 ml，至液體不見血色為止，接著灌注4%多聚甲醛PBS液約500 ml，見動(dòng)物出現(xiàn)四肢抽搐。(3)動(dòng)物四肢末端及尾尖變硬時(shí)，表示灌注完成。(4)分離紋狀體部分，修塊后置灌注液中固定過夜。(5)石蠟包埋切片，片厚5 μm。

1.4.2TH檢測方法(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化。(2)PBS(pH7.4)沖洗3次，5 min/次。(3)采用檸檬酸抗原修復(fù)液煮沸對組織進(jìn)行抗原修復(fù)。(4)PBS(pH7.4)沖洗3次，5 min/次。(5)除去PBS液，每張切片滴加50 μl一抗(工作濃度1∶50)，4℃過夜。(6)PBS(pH7.4)沖洗3次，5 min/次。(7)每張切片滴加一滴增強(qiáng)液A液，37℃反應(yīng)20 min，PBS(pH7.4)沖洗3次，5 min/次。(8)除去PBS液，每張切片滴加一滴二抗B液，37℃反應(yīng)30 min，PBS(pH7.4)沖洗3次，5 min/次。(9)除去PBS液，每張切片滴加100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察顯色1～2 min。(10)自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，鹽酸酒精分化。(11)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。(12)陰性對照一抗用PBS代替，其余步驟按以上操作。(13)鏡下觀察。

在2、4、6 w三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，每組觀察6張切片，每張切片在光鏡高倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)4 mm2視野，計(jì)算TH陽性反應(yīng)細(xì)胞。分析軟件使用IMS彩色圖像分析系統(tǒng)軟件。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS15.0軟件行t檢驗(yàn)和方差分析。

2結(jié)果

2.1各組兩側(cè)黑質(zhì)的TH陽性細(xì)胞結(jié)果鏡下觀察見TH陽性信號定位于胞質(zhì)，在正常對照組、假手術(shù)組的黑質(zhì)均可見密集的TH陽性細(xì)胞，呈棕褐色，這些細(xì)胞體主要為圓形或卵圓形，少數(shù)為多邊形，且左右兩側(cè)的細(xì)胞數(shù)目相近，隨著時(shí)間的增加變化不明顯。LD模型組及復(fù)方地黃方組損毀對側(cè)(左側(cè))仍可見密集的TH陽性細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常對照組、假手術(shù)組相近，但LD模型組損毀側(cè)(右側(cè))黑質(zhì)可見少量、稀疏TH陽性細(xì)胞，且隨著用藥時(shí)間的增加陽性細(xì)胞的表達(dá)數(shù)逐漸減少；復(fù)方地黃方組黑質(zhì)仍可見較密集的TH陽性細(xì)胞，呈棕褐色，且隨著時(shí)間的遞增陽性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)呈遞增趨勢。

2.2復(fù)方地黃方對LD大鼠黑質(zhì)TH的影響LD模型組和復(fù)方地黃方組TH的表達(dá)均低于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的正常對照組和假手術(shù)組(P<0.001)。復(fù)方地黃方組TH表達(dá)均高于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的LD模型組，其中治療4 w、6 w差異顯著(P<0.001)。隨著時(shí)間的延長，LD模型組TH表達(dá)呈不斷減少趨勢，治療6 w與治療2 w比較差異顯著(P<0.01)，復(fù)方地黃方組TH表達(dá)呈不斷增加趨勢，治療6 w與治療4、2 w比較差異顯著(P<0.001)。見表1。

表1　復(fù)方地黃方對LD大鼠黑質(zhì)TH的影響

與正常對照組比較：1)P<0.001；與假手術(shù)組比較：2)P<0.001；與LD模型組比較：3)P<0.001；與治療2 w比較：4)P<0.01,5)P<0.001；與治療4 w比較：6)P<0.001

3討論

PD是一種多種原因、多種機(jī)制參與的難治性疾病，其主要病理改變是DA能神經(jīng)元變性、死亡，導(dǎo)致黑質(zhì)、紋狀體通路上DA含量降低。TH是DA的蛋白特異性標(biāo)志，反映DA數(shù)量的變化。本實(shí)驗(yàn)提示PD患者應(yīng)用LD治療過程中，存在DA神經(jīng)元的減少，這可能與TH的活性受到抑制有關(guān)。

PD屬于祖國醫(yī)學(xué)的“顫證”范疇。通過長期的研究發(fā)現(xiàn)，PD的病因病機(jī)除主要有“虛”、“瘀”、“痰”等三個(gè)方面外，尚有LD長期蓄積之“毒”邪為害，因此其治宜多法復(fù)方，諸法共用，綜合調(diào)治，確立了“滋補(bǔ)肝腎、平肝熄風(fēng)、化痰祛瘀、解毒散結(jié)”的基本治療法則〔6，7〕。復(fù)方地黃方便是基于此治則確立的中藥復(fù)方，由熟地黃、珍珠母、白芍、鉤藤、丹參、石菖蒲、全蝎等組成。方中以熟地補(bǔ)腎益精、滋陰養(yǎng)血、固本培元為用；珍珠母滋陰潛陽、定驚止顫、養(yǎng)血舒筋，以達(dá)柔肝與熄風(fēng)、滋陰與養(yǎng)血之功；合白芍、鉤藤、丹參、石菖蒲、全蝎等，共奏滋腎、補(bǔ)肝、熄風(fēng)、化痰、祛瘀、通絡(luò)、散結(jié)、解毒之功。本研究表明復(fù)方地黃方有增加TH表達(dá)的作用。

大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，TH在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中的表達(dá)變化會直接影響到DA 的生物合成，其含量與功能不足是導(dǎo)致PD一系列臨床癥狀的重要環(huán)節(jié)〔8〕。研究〔6〕發(fā)現(xiàn)，復(fù)方地黃方對PD神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。結(jié)合本研究結(jié)果，提示復(fù)方地黃方可能通過增加TH的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)其活性，有效地抑制PD神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而起到較好的治療PD及緩解LD毒副反應(yīng)的作用。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-09-17修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)