TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯(lián)合衣霉素促進人乳腺癌細胞凋亡

林哲洙張紅張磊羅文棟

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院腫瘤外科，遼寧錦州121000)

摘要〔〕目的觀察TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯(lián)合衣霉素促進人乳腺癌細胞凋亡作用。方法取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7接種，隨機分為對照組、衣霉素組、TR4單抗組及TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組。采用MTT比色法測定24、48、72、96 h各組細胞增殖情況。利用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。結(jié)果TR4單抗組、衣霉素組及TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組MCF-7細胞增殖曲線較對照組呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢，其中24 h時最為明顯。對照組、TR4單抗組、衣霉素組及TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組細胞凋亡率為0.44%、10.12%、14.85%、36.51%，，各組間細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)。結(jié)論TRAIL-R4通過結(jié)合癌細胞表面的死亡受體來誘導(dǎo)或促進腫瘤細胞的凋亡；聯(lián)合衣霉素能更好地促進TRAIL-R4對乳腺癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用，具體的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制需要深入的研究來證實。

關(guān)鍵詞〔〕TRAIL-R4；衣霉素；乳腺癌細胞；凋亡

中圖分類號〔〕R737.11〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：遼寧醫(yī)學(xué)院博士啟動項目(No.Y2011B09)

第一作者：林哲洙(1973-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤學(xué)及普通外科學(xué)研究。

目前尚無較為有效且安全性好的乳腺癌治療方法，手術(shù)、化放療、內(nèi)分泌治療等手段均存在一定的局限性。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是與細胞死亡密切相關(guān)的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，能與死亡受體(DR)4等相結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生特異性凋亡，因而成為應(yīng)用前景廣泛的抗腫瘤制劑〔1～3〕。近幾年，針對抗-DR4的單克隆激動劑抗體的研究報道較多，此類抗體的作用或效果比TRAIL更為明顯〔4，5〕，且穩(wěn)定性也較TRAIL重組體更為顯著。但TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯(lián)合衣霉素在人乳腺癌細胞凋亡中的研究尚未有報道。本研究利用TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯(lián)合衣霉素，觀察對人乳腺癌細胞系MCF7中腫瘤細胞的增殖及凋亡的影響。

1材料與方法

1.1主要材料 DMEM細胞培養(yǎng)液購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，胎牛血清購自上海勁馬生物科技有限公司，重組人TRAIL(可溶性)為近岸蛋白質(zhì)科技有限公司產(chǎn)品，衣霉素購自上海研拓生物科技有限公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche羅氏。人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國BD公司。

1.2細胞增殖檢測采用MTT比色法進行細胞測定，取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7接種于96孔板，37℃培養(yǎng)12 h后，隨機分為對照組、衣霉素組、TR4單抗組及TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組。將細胞按4×104個/孔接種于96孔板，37℃培養(yǎng)，24 h過夜。其中對照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)；TR4單抗組加入TR4單抗，濃度為1.5 mg/L；衣霉素組采用DMSO培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 mg/L；TR4單抗組直接加入TR4單抗，濃度為1.5 mg/L；TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組先用衣霉素處理12 h后，再加入TR4單抗處理，均37℃培養(yǎng)48 h。測定24、48、72、96 h各組細胞增殖情況。

1.3流式細胞術(shù)取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7細胞用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋至一定濃度，并接種于6孔培養(yǎng)板，每一孔約2 ml，細胞數(shù)每孔約4×105個，37℃下，5%CO2培養(yǎng)24 h，隨機分組為對照組、衣霉素組、TR4單抗組及TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組。其中對照組加入等體積DMSO；衣霉素組采用DMSO培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 mg/L；TR4單抗組加入TR4單抗，濃度為1.5 mg/L，37℃恒溫，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；TR4單抗-衣霉素聯(lián)合組先用衣霉素處理12 h后，再加入TR4單抗處理，均37℃培養(yǎng)48 h，收集細胞，以冷磷酸緩沖液(PBS)沖洗3遍。吸取100 μl細胞懸液(含1×105個細胞)至5 ml培養(yǎng)管中，加入5 μl Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑+5 μl PI液，輕柔搖勻，室溫下避光15 min，到溶液穩(wěn)定后加入緩沖液400 μl混合后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行t、χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1 不同組別MTT檢測結(jié)果比較TR4單抗、衣霉素顯示明顯的抑制MCF-7細胞生長的作用，TR4單抗組、衣霉素組及聯(lián)合組MCF-7細胞增殖曲線較對照組呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢，其中24 h時最為明顯。見圖1。

圖1　不同培養(yǎng)時間下各組別細胞增殖情況

2.2不同組別乳腺癌細胞凋亡情況TR4單抗、衣霉素單獨應(yīng)用能引起部分人乳腺癌細胞的凋亡，聯(lián)合應(yīng)用凋亡作用增強明顯，對照組、衣霉素組、TR4單抗組和聯(lián)合組細胞凋亡率分別為0.44%、10.12%、14.85%、36.51%，各組差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2　不同處理條件下細胞凋亡情況

3討論

乳腺癌發(fā)病率居高不下，呈現(xiàn)逐年上升趨勢，尤其是在我國經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)則更為明顯〔6，7〕。腫瘤是一種基因性疾病，是患者體內(nèi)的多種原癌基因可能被激活所導(dǎo)致〔8，9〕。因此，探索有效且安全殺傷乳腺癌細胞的藥物是目前研究的熱點〔10～14〕。鑒于TRAIL可選擇性地誘導(dǎo)癌細胞凋亡，而對正常細胞較為安全，且針對TRAIL 敏感性的調(diào)控因子及機制的研究有助于腫瘤治療，已在腫瘤治療領(lǐng)域成為關(guān)注焦點〔15〕。TRAIL-Rs在多種細胞中均有表達，包括腫瘤及正常細胞〔16〕。其配體可激活TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)兩種功能性受體來誘導(dǎo)并加速或促進相應(yīng)腫瘤細胞的凋亡，不過，腫瘤細胞針對藥物容易產(chǎn)生抗藥性，所以針對TRAIL被應(yīng)用為抗腫瘤藥的開發(fā)尚未被廣泛利用〔17～19〕。

衣霉素是放線菌產(chǎn)生的一種核苷酸抗生素，具有一定的抑制病毒繁殖的作用。衣霉素對人肺腺癌A549細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)存在明顯的誘導(dǎo)作用，可加速人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)凋亡細胞的凋亡〔20〕，與其他試劑聯(lián)合有效上調(diào)TRAIL或TRAIL單克隆抗體的死亡受體的表達是一個有吸引力的想法，特別是在腫瘤顯示TRAIL的內(nèi)在性耐藥的情況下。TR4誘導(dǎo)的細胞凋亡具有明顯的特征性，即對不同的癌細胞有不同的敏感性及抗性，研究〔21〕顯示，用經(jīng)化療藥處理后的癌細胞進行試驗，其可以明顯逆轉(zhuǎn)癌細胞對TR4的抗性，聯(lián)合化療藥物對于癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用較為明顯。TR4的活性作用機制推測為：利用與其受體的結(jié)合來促使癌細胞的凋亡，TRAIL的受體基因一般是定位于8q21-22，TRAIL的凋亡信號傳導(dǎo)必須通過FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)傳入胞質(zhì)的下游。TR4通過活化半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶等系列分子來參與啟動凋亡的過程。衣霉素可通過上調(diào)TRAIL R1和TRAIL R2達到增強人結(jié)腸癌細胞和前列腺癌細胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡敏感性的目的〔22～24〕，Jung等〔25〕通過染色流式細胞儀檢測衣霉素與TRAIL作用于細胞前后的細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，衣霉素可明顯增加TRAIL誘導(dǎo)的胃腺癌細胞凋亡率。本研究結(jié)果可能是衣霉素通過上調(diào)細胞表面的TRAIL受體表達來增強乳腺癌細胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡敏感性。可見，衣霉素自身不但具有一定的凋亡誘導(dǎo)作用，同時還可能通過啟動TRAIL的凋亡誘導(dǎo)程序，誘導(dǎo)并促使乳腺癌細胞TRAIL4的表達的增高，促進腫瘤細胞凋亡。但其具體的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制需要深入研究證實。

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〔2014-09-06修回〕

(編輯苑云杰)