尾加壓素Ⅱ?qū)x-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞凋亡的影響

高宇鐘秀宏1黃麗紅2

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，吉林長春130033)

摘要〔〕目的探討尾加壓素Ⅱ(UⅡ)對ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞凋亡的影響，并探討其可能機制。 方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV304，將不同濃度UⅡ及ox-LDL與內(nèi)皮細胞共同孵育24 h后，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測內(nèi)皮細胞活性，TUNEL、流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞凋亡,免疫組化法檢測內(nèi)皮細胞凋亡基因bcl-2,bax,caspase-3 蛋白表達水平。結(jié)果ox-LDL(20 μg/ml)處理24 h后,可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡；同時給予不同濃度的UⅡ(20 μg/ml ox-LDL+10-10 mol/L UⅡ，20 μg/ml ox-LDL+10-9 mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-8 mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-7 mol/L UⅡ)處理24 h后，可顯著增強ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡作用，并呈濃度依賴性。ox-LDL處理內(nèi)皮細胞24 h后，bcl-2 蛋白陽性表達率降低，而bax、caspase-3陽性表達率升高。同時給予UⅡ可增強促凋亡作用，與ox-LDL組比較，ox-LDL+UⅡ 組的bcl-2 蛋白陽性表達率顯著降低(P<0.05)，而bax、caspase-3陽性表達率顯著升高(P<0.05)。結(jié)論UⅡ可增強ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡,并呈濃度依賴性，其作用可能與bcl-2、bax、caspase-3調(diào)節(jié)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕尾加壓素;ox-LDL;內(nèi)皮細胞;凋亡

中圖分類號〔〕R592〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：吉林省科技廳國際合作處

通訊作者：黃麗紅(1968-)，女，副教授，博士，主要從事老年病的診斷及治療研究。

1吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院老年病科

第一作者：高宇(1975-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事腦血管病的診斷及治療研究。

血管內(nèi)皮細胞(EVC)損傷或功能障礙在動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病中起重要作用〔1〕。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)具有很強的細胞毒性，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，參與AS的發(fā)生發(fā)展〔2〕。近年研究表明,尾加壓素Ⅱ(UⅡ)具有誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞凋亡作用〔3〕。本研究旨在觀察UⅡ?qū)x-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響，并探討bcl-2 、bax、caspase-3在誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡中的作用。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器大鼠UⅡ(美國Phoenix Pharmac ZNC)，乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco公司)，ox-LDL、噻唑藍(Sigma公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(杭州四季青生物公司);bcl-2、bax、caspase-3鼠抗人單克隆抗體;原位細胞凋亡檢測試劑盒;二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液：北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;溴乙錠(EB)，美國Sigma公司產(chǎn)品 。 倒置顯微鏡、CO2養(yǎng)箱、 超凈臺、酶聯(lián)免疫檢測儀、DYY-Ⅲ8A電泳儀、 流式細胞儀。

1.2細胞分組及藥物處理EVC-304細胞隨機分為空白對照組，細胞對照組(20 μg/ml ox-LDL)，20 μg/ml ox-LDL+10-10mol/L UⅡ，20 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-8mol/L UⅡ組,20 μg/ml ox-LDL+10-7mol/L UⅡ組。培養(yǎng)24 h，觀察細胞的變化。將對數(shù)生長期的細胞按所需濃度接種，待4 h后細胞完全貼壁，ox-LDL和UⅡ處理，培養(yǎng)至預(yù)定時間，收集各組細胞進行以下實驗，每個實驗至少重復(fù)3次。

1.3形態(tài)學(xué)觀察各組細胞定時用倒置顯微鏡觀察形態(tài)變化。

1.4四甲基偶氮唑藍實驗法(MTT 法)取狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的EVC-304，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，EDTA消化制成單細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)細胞量，細胞按1×105/ml接種于96孔板，每孔200 μl，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，初步確定用藥范圍。 各組均設(shè)3個復(fù)孔，4 h貼壁后,除空白對照組外，其余各組加終濃度為20 μg/ml ox-LDL,然后除空白對照組和細胞對照組加20 μl生理鹽水外，其余實驗組加入不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)UⅡ 20 μl處理 ，培養(yǎng)24 h，藥物終止前4 h加MTT,每孔加人新配制的MTT液(5 mg/ml)20 μl，置于孵育箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入 200 μl DMSO，用酶標(biāo)儀于490 nm波長測吸光度值，實驗重復(fù)3次。

1.5采用TUNEL法檢測細胞凋亡細胞爬片標(biāo)本制作如上述，4%多聚甲醛在常溫下固定30 min,PBS洗2 min×2次，蒸餾水洗滌2 min×2次，試驗操作按北京中山生物技術(shù)有限公司試劑說明書進行，并略加修正。

1.6流式細胞儀測定取對數(shù)生長期的EVC-304細胞,EDTA消化，制備成單細胞懸液，置于25 ml的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細胞對照組和實驗組加入ox-LDL，使其終濃度為20 μg/ml，然后實驗組各組加入UⅡ，使其終濃度分別為(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)，孵育24 h，細胞對照組和空白對照組加入等體積的生理鹽水，將培養(yǎng)瓶置入37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后收集細胞，PBS洗滌2次后離心，制備成細胞懸液；70%乙醇固定，4℃保存過夜，將單細胞懸液離心后，PBS洗滌2次后離心；細胞調(diào)整在1×106ml；加入RNaseA 37℃水浴30 min；再加EB染色液4℃避光30 min；上機行流式細胞儀測定，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，檢測凋亡率，分析細胞周期分布狀況。

1.7免疫細胞化學(xué)染色檢測 bcl-2、 bax、caspase-3蛋白表達取對數(shù)生長期細胞，收集各組細胞，制備細胞涂片，4%多聚甲醛固定后，空氣中晾干，按試劑盒說明進行。免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)：bcl-2、bax、caspase-3陽性反應(yīng)為棕黃色；bcl-2、bax定位于胞質(zhì)，可見于胞膜和核膜；caspase-3定位于胞質(zhì)。隨機選取10個高倍鏡視野(>1 000個細胞)，計數(shù)陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)。

2結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下觀察UⅡ?qū)x-LDL處理后EVC-304形態(tài)和生長的影響空白對照組細胞貼壁生長,呈鋪路石狀鑲嵌排列；細胞為多角形、梭形或不規(guī)則形,邊界清楚,胞質(zhì)豐富；細胞核為圓形或橢圓形,核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮,可見核仁。細胞傳代培養(yǎng)時約30 min即開始貼壁生長，剛貼壁的細胞呈圓形,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切巍⑺笮位虿灰?guī)則形,細胞間相互連接，見圖1。

細胞對照組細胞體積變小，細胞變圓，細胞膜完整，染色質(zhì)凝聚，細胞折光能力降低，貼壁能力明顯減弱，吹打易離壁漂浮，生長受抑制(圖2)；20 μg/ml ox-LDL+UⅡ10-7mmol/L組細胞體積變小、細胞變圓，細胞膜完整，染色質(zhì)凝聚，細胞折光能力降低，貼壁能力明顯減弱，吹打易離壁漂浮，隨濃度升高生長受抑制明顯，見圖1。

圖1　倒置顯微鏡觀察各組EVC-304細胞形態(tài)(×100)

2.2MTT法測定UⅡ?qū)x-LDL處理后EVC304增殖的影響體外培養(yǎng)的EVC304細胞分別在培養(yǎng)液及20 μg/ml ox-LDL，20 μg/ml ox-LDL+10-10mol/L UⅡ，20 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-8mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-7mol/L UⅡ分別培養(yǎng)24 h，其A 值分別為0.68±0.11,0.56±0.07，0.52±0.02，0.49±0.006，0.43±0.042，0.37±0.019，表明20 μg/ml ox-LDL 抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖，UⅡ可增強ox-LDL抑制增殖作用，且呈濃度依賴性。

2.3TUNEL法檢測細胞凋亡光鏡下可見，經(jīng)UⅡ處理24 h后，EVC-304細胞凋亡數(shù)明顯增加，棕褐色染色顆粒定位于細胞核內(nèi)，染色陽性的EVC-304出現(xiàn)核碎裂、核質(zhì)固縮、細胞膜突出形成質(zhì)膜小泡等凋亡細胞形態(tài)學(xué)變化；經(jīng)10-10～10-6mol/L UⅡ處理24 h后，AI隨UⅡ濃度的增加而增加，AI值分別為6.57±0.92,9.46±1.61,15.55±1.48,28.96±2.28；與空白對照組及細胞對照組(1.71±0.65,5.6±0.87)相比，差異均有顯著性(P<0.01)，見圖2。

圖2　TUNEL法檢測細胞凋亡(×100)

2.4流式細胞儀檢測對EVC-304細胞周期的影響及凋亡率空白對照組EVC-304細胞的DNA在G0/G1期較高為64.30%，S期為20.9%，G2/M期為16.1%。細胞對照組EVC-304細胞在G0/G1期較高為72.4.%，S期為17.1%，G2/M期為10.5%；10-10～10-7mol/L的UⅡ作用EVC-304細胞24 h后，G0/G1期細胞百分比上升(73.6%，75.9%，88.6%，90.6%)，S期(16.1%、15.9%、5.2%、3.1%)和G2/M期(10.3%，8.2%，6.2%，5.3%)細胞百分比下降，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

未用藥時，細胞培養(yǎng)24 h，凋亡細胞僅1.7%，未見亞二倍體峰(亞二倍體峰小于5%為自然凋亡峰)。經(jīng)20 μg/ml ox-LDL作用24 h后和在20 μg/ml ox-LDL基礎(chǔ)上又經(jīng)10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L UⅡ處理24 h后，均可見凋亡峰，凋亡率分別為6.7%、11.57%、15.97%、21.22%,25.87%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，實驗各組與細胞對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

2.6免疫細胞化學(xué)染色法檢測bcl-2、bax、caspase-3蛋白如圖3所示，20 μg/ml ox-LDL+10-7mol/L組bcl-2 蛋白陽性表達率為0.369±0.039，比細胞對照組(0.561±0.028)明顯降低；bax蛋白陽性表達率為 0.557±0.035，比細胞對照組(0.405±0.038)明顯增高，caspase-3蛋白陽性表達率為 0.769±0.03，比細胞對照組(0.643±0.029)明顯增高(均P<0.01)。

圖3　免疫細胞化學(xué)染色法檢測bcl-2、bax、 caspase-3蛋白(×200)

3討論

EVC細胞凋亡參與了AS的發(fā)生及發(fā)展過程，被認為是AS的始動環(huán)節(jié)〔4〕。研究表明，xo-LDL在血管內(nèi)皮損傷中起關(guān)鍵作用，其作用機制涉及炎癥、免疫等方面〔5～7〕。近年研究表明，UⅡ在EVC、平滑肌細胞、泡沫細胞、炎癥細胞中表達，其表達的改變與AS的進程有關(guān)，推測UⅡ可能直接或間接參與AS發(fā)生及發(fā)展〔8,9〕。本實驗結(jié)果證實ox-LDL 誘導(dǎo)EVC凋亡，同時UⅡ 可加強ox-LDL的促凋亡作用，且存在濃度依賴性。在細胞凋亡的過程中，caspases家族起著非常重要的作用，其中，Caspases-3是關(guān)鍵的信息分子，是凋亡機制的核心成分〔10〕。bcl-2家族蛋白可調(diào)節(jié)細胞凋亡，bcl-2是正常細胞的凋亡抑制基因,bax是促凋亡基因,bcl-2 下調(diào)及bax上調(diào),抗凋亡能力下降,細胞凋亡增加。本實驗結(jié)果再次表明，ox-LDL及UⅡ造成血管內(nèi)皮細胞凋亡是通過線粒體細胞色素C介導(dǎo)的凋亡通路，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。 提示UⅡ可增強ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡,并呈濃度依賴性，其作用可能與 bcl-2、bax、caspase-3調(diào)節(jié)有關(guān)。

4參考文獻

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〔2015-01-17修回〕

(編輯袁左鳴)