小鼠腦缺血/再灌注損傷皮質(zhì)區(qū)超氧化物歧化酶、丙二醛、活性氧表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及姜黃素的干預(yù)作用

李焰劉鳳麗1程冉冉1王芳1周燕1

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北邯鄲056002)

摘要〔〕目的探討姜黃素對(duì)小鼠皮質(zhì)區(qū)缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響及與超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)表達(dá)的關(guān)系。方法采用線栓法阻塞小鼠大腦中動(dòng)脈(MCAO)，建立小鼠局灶性腦缺血/再灌注實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?0只昆明小鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血/再灌注組(I組)和姜黃素(缺血前30 min腹腔給予10、20、40 mg/kg)組(C1、C2和C3組)，每組18只。各組于缺血2 h分為再灌24、48、72 h等三個(gè)亞組。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠神經(jīng)功能缺失的評(píng)分；TTC 染色測(cè)定腦梗死體積；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。測(cè)定各組小鼠血漿中SOD活性，MDA、ROS含量。結(jié)果24 h神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積I組明顯高于S組，C1、C2、C3組神經(jīng)學(xué)評(píng)分及腦梗死體積低于I組(P<0.05)。SOD活力I組與S組相比較明顯下降。C1、C2、C3組與I組相比SOD活力升高(P<0.05)。ROS、MDA含量I組與S組相比較明顯上升，C1、C2、C3組與I組相比ROS、MDA含量明顯下降(P<0.05)。結(jié)論姜黃素對(duì)腦缺血再灌注氧自由基損傷具有保護(hù)作用，其抗氧化作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因表達(dá)減輕細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕姜黃素；腦缺血再灌注；氧自由基損傷；凋亡

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：邯鄲市科技局課題(No.1123108080-17；1223108086-15)

1河北工程大學(xué)

第一作者：李焰(1973-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腦血管疾病治療和機(jī)制研究。

腦缺血再灌損傷與氧自由基的大量產(chǎn)生有密切關(guān)系。腦缺血再灌后氧自由基迅速增加，腦組織和血清中脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，氧自由基清除劑在腦缺血再灌時(shí)具有腦保護(hù)作用。姜黃素來(lái)源于姜科姜黃屬植物姜黃的干燥根莖，具有抗氧化、抗炎、抗感染、抗腫瘤的作用，近來(lái)研究也表明，姜黃素在抗細(xì)胞凋亡中也起著不容小覷的作用〔1〕。也有學(xué)者指出姜黃素對(duì)心肌〔2〕、腦〔3〕、腸〔4〕等臟器的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但姜黃素對(duì)于小鼠腦缺血再灌損傷的保護(hù)作用，具體機(jī)制不詳。本文通過(guò)觀察姜黃素對(duì)小鼠自由基損傷指標(biāo)的前后表達(dá)變化，結(jié)合皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，進(jìn)一步探討姜黃素抗缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及分組90只健康雄性昆明小鼠，清潔級(jí)，體重28～32 g，由河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前在22℃～25℃實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)1～2 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。動(dòng)物隨機(jī)分為：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I組)、姜黃素低、中、高劑量組(C1、C2、C3組)，治療組于腦缺血前1 h腹腔給予10、20、40 mg/kg姜黃素。每組缺血2 h再灌后分為24、48、72 h等三個(gè)亞組，每組小鼠6只，分別用于神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、TTC檢測(cè)及自由基指標(biāo)和原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)。

1.2主要試劑姜黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用二甲基亞砜溶解配置10 mg/ml儲(chǔ)存液，避光于4℃冰箱保存；活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TUNEL試劑盒購(gòu)自Santa Cruz生物公司。

1.3動(dòng)物模型的制備根據(jù)Longa等〔5〕法及國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道制作本模型，顯微手術(shù)斷開頸外動(dòng)脈后插入遠(yuǎn)端涂有硅膠約為0.1 mm的日本進(jìn)口魚線，深度為距頸總動(dòng)脈分叉處(1±0.1)cm，縫合皮膚，造成小鼠MCAO模型。90 min后，拉魚線至頸外動(dòng)脈殘端，假手術(shù)組除插線0.1 cm外，其余步驟同模型組。

1.4腦梗死灶的測(cè)定再灌注24 h后，小鼠斷頭取腦，續(xù)冠狀切成2 mm厚的腦片，于2% TTC 中染色30 min，4%多聚甲醛固定2 h以上。計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)測(cè)量每一腦切片尾側(cè)面的梗死面積，將各腦切片的梗死面積乘以2 mm (腦片厚度)再相加，既為梗死灶體積。

1.5神經(jīng)功能檢測(cè)評(píng)分動(dòng)物麻醉清醒后，參照Longa等〔5〕5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)。0分：無(wú)神經(jīng)損傷體征；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾斜；4分：不能自發(fā)行走意識(shí)喪失。

1.6TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K，濕盒中37℃孵育30 min，滴加 TUNEL混合溶液，50 μl/片，濕盒中37℃孵育60 min，滴加轉(zhuǎn)化劑 AP，50 μl/片，濕盒中37℃孵育30 min，DAB顯色，脫水，透明，封片。以不含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的液體代替TUNEL 混合液作陰性對(duì)照。陽(yáng)性率的定量分析：每個(gè)標(biāo)本取4張切片，每張切片在海馬隨機(jī)選取4個(gè)視野，在200倍光鏡下應(yīng)用目鏡網(wǎng)格測(cè)試系統(tǒng)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7生化指標(biāo)測(cè)定再灌注后各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，處死小鼠，迅速取腦稱重。用生理鹽水制成10%腦組織勻漿液，低溫離心，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定大腦組織中SOD、ROS、MDA含量。按考馬斯亮藍(lán)法標(biāo)定蛋白含量。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能行為評(píng)分缺血后各組動(dòng)物均出現(xiàn)神經(jīng)功能損害癥狀，神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于S組(P<0.05)。與I組比較，C組神經(jīng)功能缺損評(píng)分有所下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2TTC染色結(jié)果缺血后缺血側(cè)鼠腦腫脹，有明顯的梗死灶形成，TTC染色正常腦組織呈紅色，缺血灶呈蒼白色。應(yīng)用姜黃素后可見(jiàn)明顯縮小的梗死灶(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠再灌注24 h后梗死體積比例及神經(jīng)功能

與S組比較：1)P<0.05；與I組比較：2)P<0.05；下表同

2.3腦組織勻漿MDA含量Ⅰ組與C組含量與S組比較均明顯升高(P<0.05)；C組和Ⅰ組比較，C組相同時(shí)點(diǎn)MDA含量明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4腦組織勻漿ROS含量I組與C組含量與S組比較均明顯升高(P<0.05)；C組和I組比較，C組相同時(shí)點(diǎn)ROS含量明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.5腦組織勻漿SOD含量I組與C組含量與S組比較均明顯降低(P<0.05)；C組和I組比較，C組相同時(shí)點(diǎn)SOD含量明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表2　各時(shí)間點(diǎn)腦組織勻漿MDA含量

表3　各時(shí)間點(diǎn)腦組織勻漿ROS含量比較

表4　各時(shí)間點(diǎn)腦組織勻漿SOD含量比較

2.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果I組與S組比較，傷后24 h TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞開始顯著增加(P<0.05)，隨著時(shí)間推移陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)逐漸增多，傷后48 h達(dá)高峰(P<0.05)。C組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞各時(shí)相表達(dá)與模型組相似，但TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，各時(shí)相點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖1。

表5　各組腦組織凋亡細(xì)胞比較

圖1　各組再灌注48 h腦組織凋亡細(xì)胞(TUNEL，×200)

3討論

缺血性腦血管疾病具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了人類的健康和生命。由于大腦中動(dòng)脈是臨床缺血性腦血管病的易患部位，因而大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)是目前常用的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。本研究?fù)制的小鼠MCAO模型具有典型的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，TTC染色可見(jiàn)明顯的梗死灶，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物模型符合實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)預(yù)先給予姜黃素后，小鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯改善，腦梗死體積明顯縮小，說(shuō)明其對(duì)腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，與既往研究一致〔3〕。

本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注時(shí)體內(nèi)氧化系統(tǒng)被激活，抗氧化系統(tǒng)受抑制，氧自由基大量生成而清除減少，體內(nèi)氧自由基水平急劇升高，從而引發(fā)一定程度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。姜黃素是中藥姜黃的主要成分，其副作用小，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的藥理作用，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示〔3，6，7〕，姜黃素具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗HIV-1整合酶等作用。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明姜黃素可減少和抑制實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)自由基的生成，具有抗氧化作用〔2〕。

腦缺血再灌注后存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡，如何減少或抑制缺血再灌后神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善神經(jīng)功能障礙一直是神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)姜黃素各組可以顯著減少各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡，說(shuō)明其對(duì)凋亡通路起了負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的高峰出現(xiàn)在48 h，與SOD活性的高峰，MDA、ROS含量高峰期相比較，出現(xiàn)的較晚，推測(cè)其可能通過(guò)調(diào)控某些信號(hào)通路而抑制了細(xì)胞凋亡〔8〕。胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路十分復(fù)雜，因此還需對(duì)姜黃素抗缺血缺氧性神經(jīng)元凋亡作更為深入的研究。以進(jìn)一步明確姜黃素在腦缺血再灌注損傷中的作用。

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〔2013-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)