慢性應(yīng)激對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷及Gli1蛋白表達(dá)的影響

常庚許晶張文娣牟真常翼

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧大連116011)

摘要〔〕目的探討慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的病理機(jī)制。方法應(yīng)用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激建立抑郁癥大鼠模型，隨機(jī)分成對(duì)照組，模型組。用免疫組化法、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)海馬神經(jīng)元數(shù)目及凋亡率，用酶標(biāo)儀檢測(cè)乳酸脫氛酶(LDH)、丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，用Western印跡法檢測(cè)Gli1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果慢性應(yīng)激后，大鼠神經(jīng)元數(shù)目較對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞凋亡率、LDH、MDA含量升高；與對(duì)照組相比，模型組中抗氧化酶SOD、GSH-Px含量明顯降低，Gil1蛋白水平表達(dá)下調(diào)。結(jié)論慢性應(yīng)激可能通過抑制Gli1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷。

關(guān)鍵詞〔〕抑郁癥；慢性應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)〔〕R741〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：許晶(1955-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事認(rèn)知與情緒障礙研究。

第一作者：常庚(1981-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

抑郁癥是一種常見的情感性疾病，以情緒持久低落、思維遲緩、對(duì)工作失去興趣等癥狀為特征。海馬結(jié)構(gòu)是哺乳動(dòng)物的情感皮質(zhì)下中樞，涉及了抑郁行為、情緒或心境改變的過程，在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用〔1〕。抑郁癥發(fā)病過程中海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)容積下降和明顯的神經(jīng)元凋亡，但其具體機(jī)制尚未闡明〔2〕。臨床實(shí)驗(yàn)表明：抑郁癥患者的血清中過氧化物及氧化標(biāo)記物的含量高于正常人〔3〕，提示氧化應(yīng)激是導(dǎo)致海馬組織神經(jīng)細(xì)胞變性凋亡的重要病理機(jī)制。Gli1蛋白是重要的抗氧化蛋白〔4〕，在神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用。關(guān)于慢性應(yīng)激對(duì)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞Gli1蛋白表達(dá)的影響，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢性輕度不可預(yù)見的應(yīng)激建立抑郁動(dòng)物模型，通過檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目、凋亡率，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量及Gli1蛋白的表達(dá)，以期深入探討慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物健康清潔級(jí)SD雄性大鼠50只，體重200～250 g，鼠齡4～6 w，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。除對(duì)照組外均單籠飼養(yǎng)，自然光照，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食水。

1.2藥品及試劑測(cè)定LDH 、MDA、SOD、GSH-Px含量的試劑均采用南京建成生物工程研究所。Gil1蛋白一抗購(gòu)自 Cell Signal公司。免疫組化試劑一抗為小鼠抗非磷酸化神經(jīng)絲單克隆抗體SMI32( Sternberger Monoclona公司)。

1.3模型建立按照文獻(xiàn)〔5〕并略加改進(jìn)，將2 h行為限制、4℃冰水中游泳5 min、停水24 h、停食24 h、夾尾1 min、明暗顛倒24 h、電擊足底5 s(30 V電壓)、搖晃5 min(160 Hz)、40℃環(huán)境5 min共9種刺激隨機(jī)安排到18 d內(nèi)，每日1種，每種刺激出現(xiàn)2次，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物斷頭處死，取海馬組織制成單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，操作步驟按說明書。

1.5腦組織生化測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取腦，并將海馬組織制成10%的組織勻漿。嚴(yán)格按試劑盒說明測(cè)定腦組織中LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量。以上指標(biāo)測(cè)定用試劑均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)試完成，測(cè)試操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元4%多聚甲醛固定40 min，0.13% Triton X-100浸透10 min，10%馬血清封閉60 min，單克隆抗體SMI32搖床過夜，次日加生物素化馬抗小鼠IgG 60 min，SABC 60 min，DAB 顯色10 min，脫水、透明、封固。

1.7Gil1蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western印跡方法測(cè)定。以每個(gè)樣品的總蛋白為200 μg進(jìn)行上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，脫脂奶粉封閉，一抗封閉4℃過夜，二抗37℃孵育1 h (羊抗兔)，漂洗后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)，自動(dòng)掃描，進(jìn)行灰度分析。

2結(jié)果

2.1海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目、凋亡率及海馬組織中LDH的含量檢測(cè)與對(duì)照組比較，模型組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見圖1。應(yīng)用流式細(xì)胞儀的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過慢性應(yīng)激干預(yù)后的海馬神經(jīng)細(xì)胞在細(xì)胞周期G1期前出現(xiàn)明顯的凋亡峰，凋亡率為4.7%。與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組的海馬組織中LDH含量高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

2.2慢性應(yīng)激對(duì)海馬組織中MDA、SOD及GSH-Px含量的影響模型組的海馬組織中MDA含量高于對(duì)照組(P<0.01)。慢性應(yīng)激可以明顯降低SOD和GSH-Px的表達(dá)，模型組與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。見表1。

2.3慢性應(yīng)激對(duì)Gli1信號(hào)蛋白表達(dá)的影響Gli1蛋白的表達(dá)見圖2，模型組的海馬組織中Gli1蛋白蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組 (P<0.01)。

表1　慢性應(yīng)激對(duì)LDH、MDA、SOD及GSH-Px含量的

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

圖1　慢性應(yīng)激對(duì)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目的影響(DAB，×20)

圖2　慢性應(yīng)激對(duì)海馬組織Gli1蛋白的表達(dá)的影響

3討論

抑郁癥是一種常見的情感性疾病，因其高發(fā)病率、高自殺率，對(duì)社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)，引起了極大的關(guān)注。近年研究證實(shí)，抑郁癥不僅是精神心理性疾病，更是與腦器質(zhì)損害有關(guān)的神經(jīng)疾病。抑郁癥的發(fā)生與腦部情感相關(guān)中樞的結(jié)構(gòu)及功能的損傷密切相關(guān)。皮質(zhì)及皮質(zhì)下核團(tuán)和結(jié)構(gòu)中，與情感密切相關(guān)的部位損傷均可能出現(xiàn)抑郁癥狀及性格行為的改變，特別是海馬結(jié)構(gòu)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：在海馬結(jié)構(gòu)破壞后，動(dòng)物出現(xiàn)明顯的情感、性格和認(rèn)知變化。應(yīng)激性生活事件是抑郁癥的重要促發(fā)因素，其中慢性長(zhǎng)期的不可預(yù)見的日常壓力是引發(fā)抑郁的主要原因。慢性應(yīng)激可以引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能變化，特別是氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活。氧自由基引起的氧化損傷是腦部功能繼發(fā)性損害的主要原因。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)的自由基及其產(chǎn)物超過機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制的一種病理狀態(tài)，它通常是由于體內(nèi)的自由基顯著增高和/或機(jī)體的抗氧化防御功能下降所致。機(jī)體內(nèi)的自由基通過攻擊膜蛋白質(zhì)、核酸及生物膜上的不飽和脂肪酸，使之發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使膜結(jié)構(gòu)遭到破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂、透明質(zhì)酸解聚、細(xì)胞崩解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢性不可預(yù)見的應(yīng)激模擬造成抑郁癥的壓力源來制作抑郁動(dòng)物模型，使大鼠出現(xiàn)抑郁癥的臨床癥狀。本研究顯示，慢性應(yīng)激導(dǎo)致了抑郁癥模型鼠海馬組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率上升，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少；抑郁癥模型鼠的海馬組織中脂質(zhì)過氧化物MDA含量顯著增高，這與國(guó)外的研究是一致的。

我們進(jìn)一步探討抗氧化酶SOD、GSH在抑郁癥大鼠海馬組織中的變化。SOD和GSH是兩種體內(nèi)廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，能有效清除體內(nèi)單線態(tài)氧、超氧陰離子、羥自由基等多種自由基，防治生物膜過氧化引起的損傷，是機(jī)體抗氧化防御機(jī)制之一〔6，7〕。我們的研究顯示SOD、GSH活性顯著低于正常對(duì)照組，提示在慢性應(yīng)激進(jìn)程中，腦組織存在著氧化抗氧化系統(tǒng)失衡的表現(xiàn)，這是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死的重要原因。

Gli1蛋白是重要的抗氧化蛋白，能有效激活Sonic Hedgehog(Shh)信號(hào)通路，上調(diào)多種抗氧化酶的表達(dá)水平，減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害以達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。我們的研究表明，慢性應(yīng)激導(dǎo)致Gil1蛋白表達(dá)下降，可能是導(dǎo)致海馬組織氧化損傷的重要機(jī)制。

我們的研究證實(shí)了，在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠海馬組織中存在氧化損傷，不僅神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，而且凋亡率明顯增加。慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制在于：慢性應(yīng)激減少了海馬組織抗氧化酶的表達(dá)，下調(diào)了Gil1蛋白的表達(dá)。

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〔2014-02-17修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)