TLR4在慢性支氣管炎大鼠模型中對(duì)炎癥損傷與黏液分泌的調(diào)控作用

萬寧張建勇1

(宜賓市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川宜賓644000)

摘要〔〕目的觀察TLR4在細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)致慢性支氣管炎大鼠模型中對(duì)氣道炎癥損傷與黏液分泌的調(diào)控作用。方法SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NS組)、慢性支氣管炎組(LPS組)、多粘菌素B干預(yù)組(LPS+PMB組)、多粘菌素B自身對(duì)照組(PMB組)，每組10只。用氣管內(nèi)注入LPS 200 μg/200 μl及每日LPS溶液霧化吸入1 h的方法建立慢性支氣管炎動(dòng)物模型，3 w后收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定BALF中腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，對(duì)大鼠肺臟進(jìn)行病理學(xué)檢查，肺組織阿先藍(lán)過碘酸雪夫(AB-PAS)陽染面積，用免疫組化法觀察黏蛋白Muc5AC、TLR4在支氣管肺內(nèi)的表達(dá)及熒光定量RT-PCR Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA在肺內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果LPS組大鼠BALF細(xì)胞總計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)、TNF-α水平。AB-PAS陽染面積、Muc5AC、TLR4蛋白表達(dá)量及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA水平與LPS+PMB組比較有顯著性差異(均P<0.05)，NS組和PMB無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論TLR4介導(dǎo)LPS誘發(fā)的慢性呼吸道炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致Muc5AC 蛋白與mRNA高表達(dá)。多粘菌素B可能通過抑制肺組織TLR4 mRNA及其蛋白的表達(dá)而抑制氣道黏液高分泌。

關(guān)鍵詞〔〕慢性支氣管炎；內(nèi)毒素；多粘菌素B；TLR4；Muc5AC

中圖分類號(hào)〔〕R562.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃課題(黔科合SY字〔2008〕3056)

通訊作者：張建勇(1966-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，主要從事氣道炎癥及黏液高分泌研究。

1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科

第一作者：萬寧(1979-)，女， 碩士，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌性研究。

氣道黏液高分泌是慢性氣道疾病的重要特征，確切發(fā)生機(jī)制及調(diào)控目前尚不十分清楚。氣道黏液高分泌的分子基礎(chǔ)是氣道主要黏蛋白(Muc)5AC的產(chǎn)生和分泌增加〔1〕，而細(xì)菌感染是慢性氣道疾病發(fā)生發(fā)展或反復(fù)加重的重要因素，其中G-菌是最主要的致病菌之一，而脂多糖(LPS)則是G-菌感染的主要致病因子。本實(shí)驗(yàn)將探討TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)菌LPS誘導(dǎo)大鼠慢性支氣管炎氣道黏蛋白表達(dá)中的作用，為氣道黏液高分泌的藥物干預(yù)治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1慢性支氣管炎模型建立與分組SPF級(jí)6～8周齡雄性Wistar大鼠40只(購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重約220～240 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NS組)、慢性支氣管炎組(LPS組)、多粘菌素B干預(yù)組(LPS+PMB組)、多粘菌素B自身對(duì)照組(PMB組)，每組10只。參考Nie等〔2〕的方法，并作改進(jìn)，建立大鼠慢性支氣管炎模型：第1天氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)200 μg/200 μl(E.coli 055:B5，美國(guó)Sigma公司)后，每天在自制玻璃箱(50 cm×50 cm×40 cm)內(nèi)霧化吸入(德國(guó)百瑞壓縮吸入器，型號(hào)：085G1005)LPS溶液(50 μg/ml)1 h，連續(xù)3 w。NS組用NS代替LPS。LPS+PMB組：建立大鼠慢性支氣管炎模型(方法同前)外，于每日霧化吸入前1 h給予腹腔注射PMB 1 mg/kg干預(yù)(美國(guó)Amresco)。PMB組：同正常對(duì)照組外，于每日霧化吸入前1 h給予腹腔注射PMB 1 mg/kg。

1.2肺組織標(biāo)本和支氣管肺泡灌洗液制備大鼠持續(xù)霧化吸入3 w后處死，取右上、中葉肺組織迅速放入-80℃冰箱保存，以備RNA提取。取右下葉肺組織放入4%多聚甲醛中固定。左肺行支氣管肺泡灌洗獲得BALF做細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類和細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α測(cè)定〔3〕。

1.3ELISA測(cè)定BALF細(xì)胞因子TNF-α采用ELISA雙抗體夾心法，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)，酶標(biāo)儀(ELX800，美國(guó))在492 nm處測(cè)吸光度。

1.4AB-PAS染色肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，做AB-PAS染色，進(jìn)行圖片采集和相對(duì)著色面積定量分析。

1.5免疫組化法檢測(cè)氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達(dá)均采用二步法，Muc5AC一抗為小鼠抗Muc5AC單克隆抗體(SANTA公司)，鼠抗-Muc5AC抗體二步法試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。TLR4一抗為羊抗大鼠TLR4多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，羊抗-TLR4抗體二步法試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。均按試劑盒說明進(jìn)行操作，以積分光密度(IOD)為指標(biāo)進(jìn)行定量分析。

1.6熒光定量RT-PCR檢測(cè)肺組織Muc5AC和TLR4 mRNA表達(dá)。采用RNAiso Reagent試劑(TaKaRa公司)參照說明書提取各組大鼠肺組織總RNA，取0.5 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，DRR037S)，按試劑盒說明書合成cDNA。Muc5AC、TLR4及內(nèi)參照β-actin的引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，其序列見表1。按PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司，DRR041S)說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)(ICycler iQ熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司)，反應(yīng)條件均為：95℃ 10 s；95℃ 5 s，62℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。每一例樣本反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出定量結(jié)果Ct值。各組數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

表1　Muc5AC、TLR4、β-actin引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果NS組和PMB組大鼠支氣管管壁及其周圍組織結(jié)構(gòu)完整而清晰，未見或偶見很少量炎性細(xì)胞。LPS組見支氣管上皮細(xì)胞損傷脫落，杯狀細(xì)胞明顯增多，支氣管壁及其周圍組織和肺泡以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯處可見管壁平滑肌束斷裂，排列紊亂，管腔狹窄。與LPS組比較，LPS+PMB組大鼠上述病變明顯減輕。

2.2BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類NS組和PMB組大鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類無差異(P>0.05)，主要以巨噬細(xì)胞為主。LPS組BALF白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均較NS組明顯增多(均P<0.01)。LPS+PMB組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與LPS組比較明顯減少(均P<0.01)，而較NS組有所增加。見表2。

表2　各組大鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)變化

2.3BALF細(xì)胞因子TNF-α水平測(cè)定NS組〔(70.35±5.84)pg/ml〕和PMB組〔(71.01±3.47)pg/ml〕BALF中TNF-α水平無差異(P>0.05)，LPS組〔(172.91±4.16)pg/ml〕、LPS+PMB組〔(96.95±7.50)pg/ml〕BALF中TNF-α水平較NS組明顯增高(P<0.01)，LPS+PMB組增高值較LPS組低(P<0.01)。

2.4氣道AB-PAS染色AB-PAS染色結(jié)果顯示：NS組和PMB組氣道黏液物質(zhì)染色無明顯差別〔(1.54±0.12)%,(1.52±0.03)%〕(P>0.05)。LPS組、LPS+PMB組氣道黏液物質(zhì)相對(duì)著色面積〔(28.20±1.22)%,(13.30±1.49)%〕較NS組明顯增高(P<0.01)。LPS+PMB組增高值較LPS組低(P<0.01)。

2.5免疫組化法檢測(cè)氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達(dá)Muc5AC表達(dá)于支氣管管腔內(nèi)，其余肺組織未見表達(dá)。NS組和PMB組Muc5AC表達(dá)低，且二者無差異(P>0.05)。LPS組可見大量Muc5AC表達(dá)，其IOD值明顯高于NS組(P<0.01)。LPS+PMB組表達(dá)量較LPS組明顯減低(P<0.01)，但仍高于NS組(P<0.01)。TLR4主要表達(dá)于支氣管上皮、肺泡、血管壁等，均為膜表達(dá)。TLR4均在NS組和PMB組表達(dá)低，且無差異(P>0.05)。LPS組可見大量TLR4表達(dá)，其IOD值明顯高于NS組(P<0.01)。LPS+PMB組表達(dá)量較LPS組明顯減低(P<0.01)，但仍高于NS組(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠氣道Muc5AC和肺組織

與NS組比較：1)P<0.01，與LPS組比較：2)P<0.01；下表同

2.6熒光定量RT-PCR檢測(cè)肺組織Muc5AC和TLR4 mRNA表達(dá)NS組和PMB組大鼠氣道黏蛋白Muc5AC mRNA表達(dá)量低，且二者無差異(P>0.05)。LPS組較NS組表達(dá)明顯增高(P<0.05)，LPS+PMB組表達(dá)量增高，但低于LPS組(P<0.05)。TLR4 mRNA在NS組和PMB組大鼠肺組織表達(dá)量低，且二者無差異(P>0.05)；LPS組較NS組明顯增高(P<0.05)；LPS+PMB組表達(dá)量增高，但低于LPS組(P<0.05)。見表4。

表4　大鼠肺組織Muc5AC和TLR4 mRNA表達(dá) ± s, n=10)

3討論

氣道黏液高分泌是影響慢性氣道疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘及囊性纖維化等病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔3，4〕。黏蛋白是氣道黏液的最主要成分。研究證實(shí)，氣道Muc在病理狀態(tài)下主要表現(xiàn)為Muc5AC，氣道Muc5AC含量及其轉(zhuǎn)錄水平代表慢性支氣管炎患者氣道黏液分泌強(qiáng)度〔5〕。

由于氣道炎癥反應(yīng)及黏液分泌發(fā)生、發(fā)展與細(xì)菌感染有著直接的關(guān)系。G-菌是構(gòu)成呼吸道感染的最關(guān)鍵致病菌，而LPS是決定G-菌致病力的關(guān)鍵霉素。TLR是LPS主要受體，其作用主要體現(xiàn)在免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)。人類氣道上皮細(xì)胞存在TLR，其中TLR4主要分布于細(xì)胞基底膜。在LPS刺激下，可使TLR激活并通過TLRs信號(hào)通路介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。

在LPS刺激下，氣道上皮細(xì)胞的TLR水平升高，且主要是TLR4上調(diào)。LPS可誘使豚鼠氣道上皮黏蛋白分泌增多和杯狀細(xì)胞化生，銅綠假單胞菌脂多糖刺激NCI-H292細(xì)胞MUC5AC、TLR4基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。向大鼠氣管內(nèi)滴入綠膿假單胞菌LPS，可引起大量中性粒細(xì)胞聚集以及廣泛的氣道上皮細(xì)胞型改變，蛋白分泌明顯升高。本研究使用LPS成功搭建大鼠慢性支氣管炎和氣道黏液高分泌模型，進(jìn)一步佐證了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度決定氣道黏液分泌量的內(nèi)在關(guān)系。

作為TLR4最主要的配體，明確LPS與TLR4在慢性支氣管炎發(fā)病中扮演的角色十分必要。本研究結(jié)果顯示，LPS水平與TLR4 mRNA表達(dá)正相關(guān)；另外，低濃度LPS刺激后TLR4 mRNA表達(dá)上調(diào)，且肺組織炎癥改變加重，氣道阻力加大，氣道壁厚度增加；但高濃度LPS刺激后雖然TLR4 mRNA表達(dá)上揚(yáng)趨勢(shì)更明顯，但肺組織炎癥卻減輕，氣道阻力和氣道壁厚度均改善。由此說明，TLR4在參與支氣管炎癥發(fā)生和氣道重組過程中發(fā)揮著重要角色。

通過本研究可以推測(cè)， TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)菌LPS作用與氣道黏蛋白Muc5AC的產(chǎn)生及其高表達(dá)之間可能存在必然聯(lián)系。PMB通過對(duì)抗LPS，可能抑制氣道Muc5AC、TLR4蛋白及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)。

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〔2015-08-30修回〕

(編輯曲莉)