·基礎(chǔ)研究·

補(bǔ)陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠NF-κBp65蛋白的影響

費(fèi)洪新1周忠光劉斌

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱150040)

摘要〔〕目的研究補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)對阿爾茨海默病(AD)小鼠NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響。方法小鼠隨機(jī)分成對照組、模型組、治療組(吡拉西坦0.62 g·kg-1·d-1)、BYHWD高劑量組(37.06 g·kg-1·d-1)、BYHWD中劑量組(18.53 g·kg-1·d-1)、BYHWD低劑量組(9.26 g·kg-1·d-1)，連續(xù)治療28 d后取材。顯微鏡觀察小鼠海馬鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)。免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR及其Wester印跡檢測AD小鼠NF-κBp65蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，模型組小鼠神經(jīng)元數(shù)量減少、發(fā)生變性，NF-κBp65蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，BYHWD組海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)改善明顯，NF-κBp65蛋白水平明顯降低。結(jié)論BYHWD能維持AD小鼠神經(jīng)元的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低NF-κBp65蛋白水平。

關(guān)鍵詞〔〕補(bǔ)陽還五湯；阿爾茨海默病；NF-κB

中圖分類號〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373777，81173599)

通訊作者：周忠光(1957-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事癡呆、痛風(fēng)、腫瘤的研究。

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者：費(fèi)洪新(1978-)，男，在讀博士，講師，主要從事癡呆、痛風(fēng)、腫瘤的研究。

The effects of Buyang Huanwu decoction on the NF-κBp65 protein in Alzheimer's disease mouse

FEI Hong-Xin，ZHOU Zhong-Guang，LIU Bin.

Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040， Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of Buyang Huanwu decoction(BYHWD) on the NF-κBp65 protein in Alzheimer's disease(AD) mouse.MethodsThe mice were randomly divided into control，model，treatment(piracetam 0.62 g·kg-1·d-1)，BYHWD high-dose(37.06 g·kg-1·d-1)，BYHWD middle-dose (18.53 g·kg-1·d-1)，BYHWD low-dose(9.26 g·kg-1·d-1) groups.The mice were killed after 28 days continuous treating. After the treatment, all animals were sacrificed，morphology of hippocampal was observed. Immunohistochemical，real time quantitative PCR，Western blot were used to detect the content of NF-κBp65 protein in the hippocampal.ResultsCompared with those of control group，the mice in model group lost normal morphological structure of nerve cells and the number of nerve cells was significantly decreased，NF-κBp65 protein was significantly increased(P<0.05).Compared with that of model group，the brain maintained normal morphological structure of nerve cells，NF-κBp65 protein was significantly decreased(P<0.05)in BYHWD group.ConclusionsBYHWD could maintain normal morphological structure of nerve cells of AD mice，decrease NF-κBp65 protein responses.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Alzheimer's disease；NF-κB

阿爾茨海默病(AD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為腦組織海馬功能異常、結(jié)構(gòu)紊亂、β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積〔1〕。Zlokovic〔2〕提出AD的神經(jīng)血管假說，指出神經(jīng)血管單元包括神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、基膜，AD的神經(jīng)元及其腦血管改變引起多種級聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變、腦海馬組織對Aβ清除異常致Aβ沉積等，引起海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常。海馬組織上存在Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白受體系統(tǒng)，Aβ的清除主要通過位于海馬組織的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)及低密度脂蛋白相關(guān)蛋白(LRP)1來完成〔3〕。RAGE是海馬Aβ的主要內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過內(nèi)吞和跨膜作用結(jié)合Aβ，介導(dǎo)Aβ進(jìn)入腦組織。Aβ與RAGE相互作用導(dǎo)致，Aβ跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，并與相應(yīng)神經(jīng)元結(jié)合及核因子(NF)-κBp65介導(dǎo)活化，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子白介素(IL)-6、內(nèi)皮素(ET)-1的大量表達(dá)，同時(shí)NF-κBp65促進(jìn)了AGE蛋白與RAGE的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展〔4〕。補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)明顯改善腦缺血再灌注的損傷作用〔5〕，改善腦梗死期間血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)〔6〕，上調(diào)大鼠腦出血模型血管生成素-1的表達(dá)〔7〕，但其對AD的NF-κBp65蛋白的研究，國內(nèi)外尚無報(bào)道。本研究應(yīng)用BYHWD對AD小鼠進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究AD與NF-κBp65信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系，探求與AD治療評價(jià)密切相關(guān)的靶點(diǎn)因子。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物雄性7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖教研室吳樹亮教授贈送)；野生型C57BL/6小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司)，質(zhì)量合格證號：SCXK(京)2012-0001。小鼠常溫、常濕飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2試劑及藥品NF-κBp65(Santa Cruz Biotechnology，sc-109)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)； PrimeScript?RT reagent KIT(日本TaKaRa公司)；RNeasy@Mini Kit(美國QIAGEN公司)；吡拉西坦(湖南迪諾制藥有限公司，130325)； BYHWD包括生黃芪120g(批號131109)、當(dāng)歸尾6g(批號131001)、赤芍4.5 g(批號121003)、川芎3 g(批號20140501)、地龍3 g(批號121002)、桃仁3g(批號20140401)、紅花3 g(批號130901)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)周忠光教授購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，并由田明教授制備成水煎劑、干粉，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3儀器HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限公司)；CM1900冰凍切片機(jī)(Leica公司)；TGL-16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；PLZOZ-S電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； Applied Biosystems step one plus定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)等。

1.2方法

1.2.1基因鑒定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)APP基因和PS1基因引物，APP引物：上游：5′-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3′，下游：5′-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3′；PS1引物： 上游：5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′，下游：5-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3′。按照試劑盒說明書操作。

1.2.2分組與給藥小鼠隨機(jī)分成對照組、模型組、治療組及BYHWD高、中、低劑量組。模型組6只給予生理鹽水灌胃，治療組6只給予吡拉西坦(0.62 g·kg-1·d-1)灌胃，BYHWD高劑量組6只給予(37.06 g·kg-1·d-1)灌胃，BYHWD中劑量組6只給予(18.53 g·kg-1·d-1)灌胃，BYHWD低劑量組6只給予(9.26 g·kg-1·d-1)灌胃，對照組C57BL/6小鼠6只給予生理鹽水灌胃，各組灌胃時(shí)間28 d。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色小鼠水合氯醛麻醉后，固定小鼠，開胸尋找左心室并灌注100 ml生理鹽水，然后再用4%多聚甲醛緩慢勻速灌注固定，斷頭取腦組織固定于4%多聚甲醛之中，石蠟包埋，制備石蠟切片，切片經(jīng)過脫蠟、脫水、蘇木精染色、分化、伊紅染色、脫水、透明、干燥、封片等過程，光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色按照免疫組織化學(xué)試劑盒SP法說明書開始測定，石蠟切片需要脫蠟、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、H2O2處理、封閉、滴加一抗、水洗、滴加二抗、水洗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片等。在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)棕色細(xì)胞的陽性目標(biāo)數(shù)，每組選出6個(gè)不同的視野，采用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)每組陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)并進(jìn)行比較分析。NF-κBp65陽性為棕黃色-黃色，表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取材海馬組織，Trizol試劑盒提取海馬總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-actin引物：上游：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，下游：5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′；NF-κBp65引物：上游：5′-TGT GCG ACA AGG TGC AGA AA-3′，下游：5′-ACA ATG GCC ACT TGC CGA T-3′。 引物由中國上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系參數(shù)：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以NF-κBp65/β-actin的比值表示NF-κBp65 mRNA表達(dá)量。

1.2.6Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，冰臺上迅速取小鼠海馬，按照說明書進(jìn)行操作，加入預(yù)冷的裂解液，在冰浴下進(jìn)行勻漿，4℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，測定蛋白質(zhì)的濃度，其余上清液迅速放入液氮中，-80℃冰箱中備用。使用前加入5倍上樣緩沖液，混勻，置于100℃變性5 min。樣品蛋白經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗、二抗孵育后，利用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析處理，以目的蛋白的灰度值/β-actin條帶灰度值確定NF-κBp65的相對含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因鑒定APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可檢測到APP基因與PS1基因同時(shí)表達(dá)；野生型C57BL/6小鼠未檢測到APP基因與PS1基因同時(shí)表達(dá)，見圖1。

2.2BYHWD對小鼠海馬HE染色的影響對照組小鼠海馬錐體細(xì)胞3～4層，細(xì)胞密集，結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠海馬錐體細(xì)胞2～3層，細(xì)胞稀疏；治療組小鼠海馬錐體細(xì)胞3～4層，結(jié)構(gòu)較清晰；高劑量組海馬錐體細(xì)胞與顆粒細(xì)胞2～4層，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；中劑量組海馬錐體細(xì)胞3～4層，細(xì)胞密集；低劑量組海馬錐體細(xì)胞2～3層，分布紊亂，見圖2。

M：分子量Marker；1、3、5、6條帶為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠；2、4、7條帶為野生型C57BL/6小鼠 圖1　APP與PS1基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖(PCR法)

圖2　BYHWD對小鼠海馬HE染色的影響(×400)

2.3免疫組織化學(xué)檢測BYHWD對小鼠海馬NF-κBp65表達(dá)的影響NF-κBp65位于小鼠腦組織海馬神經(jīng)元細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或者黃色的顆粒，光鏡下觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)棕褐色為陽性，見圖3。與對照組(10.500 0±1.870 8)比較，模型組小鼠腦組織海馬NF-κBp65表達(dá)的陽性目標(biāo)數(shù)(19.166 7±2.926 9)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組(11.166 7±2.316 6)、高劑量組(12.500 0±2.881 0)、中劑量組(11.500 0±1.870 8)陽性目標(biāo)數(shù)明顯減少(P<0.05)，低劑量組(16.666 7±2.160 3)降低不明顯(P>0.05)。

2.4實(shí)時(shí)定量PCR測定BYHWD對AD小鼠海馬NF-κBp65 mRNA表達(dá)的影響與對照組(0.83±0.63)比較，模型組小鼠海馬NF-κBp65 mRNA表達(dá)量(1.27±0.16)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組(0.85±0.24)、高劑量組(1.00±0.11)、中劑量組(0.94±0.19)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，低劑量組變化不明顯(1.21±0.45，P>0.05)。

2.5Western印跡測定BYHWD對AD小鼠海馬NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響與模型組(1.93±0.25)比較，BYHWD組NF-κBp65的表達(dá)均有不同程度的降低，低、中、高劑量組分別為1.50±0.19、0.80±0.18、1.23±0.27，以BYHWD中劑量組降低最明顯，見圖4。對照組與治療組NF-κBp65蛋白表達(dá)量分別為0.93±0.12，1.01±0.28。

圖3　BYHWD對小鼠海馬NF-κBp65表達(dá)的影響(×400)

1:對照組；2:模型組；3:治療組；4:高劑量組；5:中劑量組；6:低劑量組 圖4　BYHWD對AD小鼠海馬NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響

3討論

AD病理主要表現(xiàn)為Aβ的大量沉積，正常情況Aβ水平保持動(dòng)態(tài)的平衡，一定濃度Aβ對于機(jī)體有重要的生理功能〔8〕。而RAGE和NF-κBp65內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ增加會引起Aβ水平的清除功能減弱，造成Aβ積聚，形成老年斑〔9〕?；谶@些，本課題重點(diǎn)研究NF-κBp65表達(dá)。

腦組織海馬包括CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)等，CA3區(qū)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切〔10〕。基于此，本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)重點(diǎn)研究了海馬組織CA3區(qū)的結(jié)構(gòu)。AD的研究模型包括快速老化小鼠模型、D-半乳糖注射模型、Aβ注射模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等〔11〕?；诖?，本實(shí)驗(yàn)采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，以BYHWD為處理因素，主要研究BYHWD對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織NF-κBp65表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)提示，BYHWD高、中劑量對AD小鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)改善明顯。

本研究說明模型組NF-κBp65對Aβ的清除能力減弱，導(dǎo)致Aβ的積聚，引發(fā)AD；BYHWD可以通過增加NF-κBp65的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)其對AD的治療，以此改善腦組織海馬的組織結(jié)構(gòu)，說明低劑量的BYHWD對AD模型小鼠的作用較差。以上提示BYHWD下調(diào)了海馬組織NF-κBp65的表達(dá)，增加了Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)清除功能，減少腦組織海馬的Aβ含量，以此來治療AD。另外，模型組與Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)NF-κBp65表達(dá)量增加，引起Aβ積聚，引發(fā)AD。

綜上所述，BYHWD下調(diào)腦組織海馬NF-κBp65蛋白的表達(dá)，這是BYHWD治療AD的作用機(jī)制之一，提示BYHWD治療AD的靶點(diǎn)蛋白之一是NF-κBp65蛋白，這為BYHWD通過NF-κBp65傳導(dǎo)通路治療AD提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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〔2014-12-20修回〕

(編輯李相軍)