·研究報告·

用超高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測桔梗流浸膏指紋圖譜的研究

筆雪艷1，胡畔2，張勝波3，張清波1(1. 黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測所，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.鞍山市藥品檢驗(yàn)所，遼寧 鞍山 114000； 3.濟(jì)寧市藥品檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)寧 272025)

[摘要]目的 建立桔梗流浸膏的指紋圖譜檢測方法，以達(dá)到質(zhì)量的均一和穩(wěn)定。方法采用UPLC-ELSD法，乙腈-水梯度洗脫，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.2 ml/min，在20 min內(nèi)，得到11個分離度良好的色譜峰。結(jié)果 采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算，桔梗流浸膏樣品相似度均大于0.90，符合指紋圖譜要求。結(jié)論 該方法經(jīng)穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度考察，是一種快速、準(zhǔn)確的中藥質(zhì)量評價方法。

[關(guān)鍵詞]桔梗；流浸膏；超高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測；指紋圖譜

[基金項(xiàng)目]國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高暨2015版藥典科研項(xiàng)目(TS-P021)

[作者簡介]筆雪艷，碩士，主任藥師.研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.E-mail：hljbixueyan@sina.cn

[通訊作者]張清波.E-mail:qingbo9118@sina.com

[中圖分類號]R917[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.016

[收稿日期]2014-01-04[修回日期]2014-07-18

Research on fingerprint analysis of platycodonis liquid extract by UPLC-ELSD

BI Xueyan1, HU Pan2, ZHANG Shengbo3, ZHANG Qingbo1(1. Heilongjiang Institute for Food and Drug Control, Harbin 150001, China； 2. Anshan Institute for Drug Control, Anshan 114000, China； 3. Jining Institute for Drug Control, Jining 272025, China)

Abstract[]ObjectiveTo develop a stable method for fingerprint analysis of extractum platycodi liquidum to ensure its uniformity and stability.MethodsUPLC-ELSD was applied to obtain a chromatogram with 11 well separated peaks, and the chromatographic condition was as follows: mobile phase was gradient elution by acetonitrile-water, column was ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 μm) with the column temperature of 30 ℃ and the flow rate of 0.2 ml/min.ResultsThe chromatographic fingerprints were analyzed with similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM. Similarities were all greater than 0.90, which could meet the requirement for chromatographic fingerprint of TCM.ConclusionThe stability, repeatability and precision of the developed method were all validated, and the chromatographic fingerprint analysis was a rapid and accurate method for the quality evaluation of traditional Chinese medicine.

[Key words]Platycodonis; liquid extract; UPLC; ELSD; fingerprint

桔梗流浸膏作為中成藥中投料用的一種原料，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國家衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第11冊)[1]。我國現(xiàn)有桔梗流浸膏批準(zhǔn)文號的生產(chǎn)企業(yè)為5家，以桔梗流浸膏作為處方投料的中成藥品種有14個，其中6個品種在制劑中收錄的桔梗流浸膏制法與上述標(biāo)準(zhǔn)基本相同。涉及到以桔梗流浸膏投料的中成藥廠家有300多家。在這些成方制劑的標(biāo)準(zhǔn)中，均無對桔梗流浸膏的質(zhì)量控制。而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)缺乏專屬性的質(zhì)量控制指標(biāo)。目前在桔梗的研究中，對其中藥材及飲片的研究比較多[2-8]，但對桔梗流浸膏的指紋圖譜研究目前還未見報道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超高效液相色譜(UPLC)蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)器建立桔梗流浸膏的指紋圖譜檢查方法，從而對桔梗提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行有效控制。

1儀器與試藥

ACQUITY超高效液相色譜儀：美國Waters公司(配有二元高壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、低噪音空氣泵、柱溫箱、蒸發(fā)光檢測器以及Empower數(shù)據(jù)處理工作站)；對照品：桔梗皂苷D(批號：111851-201001，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈為色譜純(美國Burdick&Jackson公司)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

桔梗流浸膏樣品(10個批次)：實(shí)驗(yàn)室自制，藥材來源：河北安國、大慶林甸、齊齊哈爾、安徽亳州、湖北、湖北磐山、山東淄博、吉林延吉、陜西、河南。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.2 ml/min，檢測器：ELSD；氣體壓力：40 psi；漂移管溫度：80 ℃；霧化器方式：冷卻。流動相：乙腈-水梯度洗脫：0～5 min, 20:80； 5～18 min, 24:76；18～20 min, 25:75；進(jìn)樣量：1 μl。

2.2供試品溶液的制備精密量取桔梗流浸膏樣品2 ml，置蒸發(fā)皿中低溫蒸至無醇味，殘渣加水2 ml使其溶解，上于D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑2 cm，長15 cm)，分別以200 ml水和150 ml 80%乙醇洗脫，收集醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至10 ml量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，注入超高效液相色譜儀，測定，即得。

2.3參照物溶液的制備精密稱取桔梗皂苷D對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.2 mg桔梗皂苷D的溶液作為參照物溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度精密吸取同一批桔梗流浸膏樣品溶液1 μl，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次測定，計算11個色譜峰的保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。相對保留時間的RSD為0.04%～0.70%，相對峰面積的RSD為0.19%～1.17%，均<2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性分別取同一批桔梗流浸膏6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照所建立的UPLC指紋圖譜分析條件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，桔梗流浸膏的主要色譜峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.48%，相對峰面積的RSD為0.44%～1.44%，均<2.0%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性取“2.4.2”項(xiàng)下制備的其中1份桔梗流浸膏供試品溶液于室溫放置，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測定，桔梗流浸膏的主要色譜峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.22%，相對峰面積的 RSD為0.17%～1.25%，均<2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5桔梗流浸膏指紋圖譜的建立

2.5.1樣品的制備采用10批不同產(chǎn)地的桔梗藥材按文獻(xiàn)[1]中制法制備桔梗流浸膏樣品。

2.5.2測定方法取上述10批桔梗流浸膏按“2.2”項(xiàng)下制成供試品溶液，精密吸取1 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下條件測定，并用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對其色譜圖進(jìn)行相似度評價，建立桔梗流浸膏的指紋圖譜，并計算相似度。色譜圖見圖1～3。

圖1　桔梗皂苷D的超高效液相色譜圖

圖2　桔梗流浸膏的超高效液相色譜對照指紋圖譜

圖3　10批桔梗流浸膏超高效液相色譜指紋圖譜

2.5.3共有峰的確定為了準(zhǔn)確有效地識別指紋圖譜，根據(jù)桔梗流浸膏指紋圖譜中各色譜峰的分離情況確定11個指紋共有峰，即圖2中1～11號峰。通過與對照品對照，確認(rèn)5號峰為桔梗皂苷D。

2.5.4桔梗流浸膏相似度測定結(jié)果依照本研究確定的UPLC指紋圖譜條件對10批桔梗流浸膏樣品進(jìn)行測定，并導(dǎo)入相似度評價系統(tǒng)進(jìn)行比較分析。以10批樣品的色譜圖建立參照圖譜，以上述確定的11個共有峰作為校正點(diǎn)，采用中位數(shù)法進(jìn)行相似度的評價分析，詳見表2。由相似度計算結(jié)果所示，10批桔梗流浸膏樣品的相似度均>0.90。

3討論與分析

3.1檢測器的選擇由于桔梗中的有效成分為皂苷類，其在紫外區(qū)均為末端吸收，在使用紫外低波長檢測時，往往會受到溶劑干擾，使結(jié)構(gòu)相似的桔梗皂苷難以得到有效分離。因此采用蒸發(fā)光散射檢測法。

3.2流動相的選擇通過對乙腈(V/V)-水(V/V)、甲醇(V/V)-水(V/V)和乙腈-0.5%甲酸水(V/V)系統(tǒng)的考察，結(jié)果表明：應(yīng)用乙腈(V/V)-水(V/V)系統(tǒng)洗脫，可對桔梗流浸膏樣品取得較好的分離。

表2　10批桔梗流浸膏相似度計算結(jié)果

3.3色譜柱的選擇分別試用了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱、ACQUITY UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱和ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱，采用上述確定的流動相系統(tǒng)，進(jìn)行桔梗流浸膏樣品的UPLC分析。結(jié)果表明：應(yīng)用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱，可對桔梗流浸膏樣品得到較好的分離。

3.4柱溫的選擇實(shí)驗(yàn)考察了30、35、40 ℃ 3個柱溫條件，結(jié)果表明：柱溫30 ℃時指紋圖譜基線平穩(wěn)，各成分分離效果好。

3.5流速的選擇本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.1、0.2、0.3 ml/min 3個流速。當(dāng)流速為0.3 ml/min時，隨著保留時間的縮短，有些色譜峰即重疊；流速為0.2或0.1 ml/min時，各成分的分離效果較好，本研究選擇流速為0.2 ml/min。

桔梗的成分十分復(fù)雜，且含有多對同分異構(gòu)體。因采用HPLC的分析時間較長，故本實(shí)驗(yàn)采用UPLC色譜技術(shù)，它與傳統(tǒng)的HPLC法相比，具有縮短分析時間、增加峰容量、提高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，因此是一種快速、準(zhǔn)確的中藥質(zhì)量評價方法。

【參考文獻(xiàn)】

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].第11冊.1996：149.

[2]許傳蓮，鄭毅男，楊臘虎，等.HPLC法測定不同采收期及不同部位桔梗中桔梗皂苷D含量[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，23(1)：58-60,64.

[3]朱丹妮,舒孌,郅慧，等.HPLC-ELSD法測定桔梗中桔梗皂苷D的含量[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，2001，10(4)：11-13.

[4]許傳蓮，楊臘虎，鄭毅男，等.應(yīng)用RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地桔梗中桔梗皂苷D[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999，21(4)：35-38.

[5]黃櫻，史春蕾，劉墨祥，等.HPLC-ELSD法測定桔梗飲片中8種桔梗皂苷的含量[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，11(4)：41-44.

[6]石俊英，王穎，鞏麗麗，等.HPLC法測定桔梗不同部位、不同產(chǎn)地藥材中桔梗皂苷D含量[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，31(6)：501-503.

[7]李喜鳳，劉素梅，李振國.RP-HPLC法測定桔梗中桔梗皂苷D的含量[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(2)：283-284.

[8]李文庭，祝明，馬臨科，等. 桔梗的HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(22)：50-53.

[本文編輯]李睿旻