·論著·

人血漿中甲氨蝶呤的高效液相色譜法測定及其代謝物的質(zhì)譜定性分析

王漪璇，毋丹，曹軍寧，錢雋 (復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032)

[摘要]目的 建立固相萃取-高效液相色譜法測定人血漿中的甲氨蝶呤濃度，用于臨床治療的監(jiān)測，并通過質(zhì)譜對甲氨蝶呤的人體代謝物進行定性分析。方法 血漿樣本經(jīng)C18固相萃取小柱凈化洗脫后直接進樣，以Diamonsil C18分析柱(150 mm×4.6 mm, 5 m)分離，流動相為甲醇和0.5%乙酸溶液(含0.3%三乙胺)，采用梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；紫外檢測波長為306 nm。通過質(zhì)譜全掃描(QLMS)和多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI)獲得甲氨蝶呤代謝物的質(zhì)譜信息。結(jié)果 甲氨蝶呤在0.05～100 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，提取回收率>95%，準(zhǔn)確度在97%～105%之間，日內(nèi)與日間精密度(RSD)均<5%。分析甲氨蝶呤代謝物的質(zhì)譜信息，推斷該代謝物為7-羥基甲氨蝶呤。結(jié)論 本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便，適用于甲氨蝶呤的血藥濃度監(jiān)測。

[關(guān)鍵詞]甲氨蝶呤；高效液相色譜法；固相萃?。淮x物

[作者簡介]王漪璇，中藥師.E-mail：13564899963@139.com

[通訊作者]錢雋，副主任藥師.研究方向：臨床藥理學(xué).Tel:(021)64175590-81112；E-mail：junqian@fudan.edu.com

[中圖分類號]R917.1[文獻標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.013

[收稿日期]2014-04-03[修回日期]2014-06-26

Determination of methotrexate in human plasma by HPLC and qualitative analysis of its metabolite by mass spectrometry

WANG Yixuan, WU Dan, CAO Junning, QIAN Jun(Department of Medical Oncology,Cancer Hospital Affilliated to Fudan University; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Abstract[]ObjectiveTo develop an SPE-HPLC method for the determination of methotrexate (MTX) in human plasma to monitor the clinical drug use of MTX, and to identify the human metabolite of MTX by mass spectrometry.MethodsMTX was extracted from human plasma using C18 SPE column and analyzed directly after elution. The separation of MTX was performed on Diamonsil C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 m) with a gradient mobile phase of methanol and 0.5% acetic acid solution (containing 0.3% triethylamine) at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was 306 nm. QLMS and MRM-IDA-EPI scan modes were used to obtain the mass spectrum of MTX metabolite.ResultsThe calibration curve of MTX in plasma was linear over the range of 0.05-100 μmol/L(r=0.999 9). The extraction recovery was above 95% and accuracy was between 97% and 105%. Both intra-and inter-day precision were less than 5%. 7-OH MTX was identified to be the metabolite through the analysis of the mass spectrum.ConclusionThe method is sensitive, reproducible, easy to operate and suits for monitoring the concentration of MTX in clinical practice.

[Key words] methotrexate; HPLC; solid phase extraction; metabolite

甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)為抗葉酸類抗腫瘤藥，臨床上廣泛用于白血病、淋巴瘤、骨肉瘤的化療。但其毒性大且在人體內(nèi)的代謝存在很大個體差異，當(dāng)MTX給藥后48 h血漿濃度在1.0 μmol/L、72 h血漿濃度在0.1 μmol/L以上時，會造成嚴(yán)重的甚至致命的毒性反應(yīng)[1,2]，必須及時給予亞葉酸鈣(calcium folinate, CF)解救，因此大劑量使用MTX須及時監(jiān)測患者的血藥濃度。高效液相色譜法(HPLC)是治療藥物濃度監(jiān)測的主要方法之一。已有很多文獻[3-11]報道，應(yīng)用HPLC法測定生物樣品中MTX。本研究簡化了原本煩瑣的固相萃取過程，洗脫、濃縮一步完成且最低定量限達到0.05 μmol/L。同時收集患者血漿中MTX代謝物，通過質(zhì)譜對其進行定性分析，確證了色譜中MTX代謝物為7-羥基甲氨蝶呤(7-OH MTX)。

1材料與方法

1.1儀器Agilent 1100 高效液相色譜儀、G1314A紫外檢測器、HP Chem Station 工作站 V4.01(美國Agilent公司)；API 3200 QTRAP三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子(ESI)源、操作軟件Analyst 1.5(美國AB SCIEX 公司)；Prominence UFLC液相色譜系統(tǒng)，包括LC-20AD梯度泵、SIL-20ACHT自動進樣器、CTO-20A柱溫箱和DGU-20A3脫氣機(日本島津公司)；Bond Elut C18固相萃取小柱(100 mg/ml，美國Agilent公司)。

1.2藥品與試劑MTX對照品(純度99.6%，批號：100138-200603，中國藥品生物制品檢定所)；對氨基苯乙酮(分析純，批號：28295，上海晶純試劑有限公司)；甲醇(色譜純，德國Merck公司)；三乙胺和乙酸均為國產(chǎn)分析純。

1.3HPLC色譜條件(MTX定量測定)色譜柱：Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 m，Dikma)；流動相A為0.5%乙酸溶液(含0.3%三乙胺)，流動相B為甲醇，梯度洗脫見表1；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：306 nm；進樣量：20 μl。

表1　梯度洗脫程序

1.4液質(zhì)聯(lián)用(代謝物定性分析)

1.4.1色譜條件色譜柱：Column Technology C18柱(50 mm×2.1 mm，3 m)；流動相A為2 mmol/L乙酸銨，乙酸調(diào)pH值至4.0，流動相B為乙腈。梯度洗脫見表1；流速：0.3 ml/min；柱溫：35 ℃。進樣量：5 μl。

1.4.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)正離子檢測，采用全掃描(QLMS)和多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI)，氣簾氣(CUR)壓力為30 psi；霧化氣(GS1)壓力為35 psi；碰撞氣(GS2)為40 psi，電噴霧電壓(IS)為5 000 V。全掃描質(zhì)量數(shù)范圍：50～500；MRM選擇監(jiān)測離子對：m/z455→308、m/z471→324；IDA采集閾值：1 000 cps；EPI掃描速率：1 000 Da/s；掃描質(zhì)量數(shù)范圍：50～500。

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.5.1工作溶液精密稱取11.36 mg的MTX對照品，加入甲醇溶解并定容，配制得1 000 μmol/L的MTX標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別用50%甲醇稀釋至0.50、1.00、2.50、10.0、25.0、100、250 μmol/L，作為MTX標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。吸取MTX 標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別用50%甲醇稀釋至1.00、10.0、80.0、800 μmol/L，作為MTX質(zhì)控點工作液。精密稱取10.05 mg的對氨基苯乙酮對照品，加入甲醇溶解并定容，配制得5 g/L的內(nèi)標(biāo)儲備液。將此溶液稀釋50倍，獲得濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。所有儲備液和工作液均保存在4 ℃冰箱中備用。

1.5.2血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品向健康人空白血漿添加適量MTX系列工作溶液，配制成濃度為0.05、 0.10、 0.25、1.00、2.50、10.0、25.0、100 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。向人空白血漿添加MTX質(zhì)控點工作液，得到濃度分別為0.10、1.00、8.00、 80.0 μmol/L的質(zhì)控樣品。

1.6血漿樣品的處理

1.6.1液相進樣樣品在每毫升血漿樣品中加入10 μl內(nèi)標(biāo)溶液，即獲得含內(nèi)標(biāo)1 mg/L的載樣血漿。取Bond Elut C18小柱，先以甲醇2 ml活化和超純水2 ml平衡，繼加入0.8 ml載樣血漿，再以1 ml生理鹽水淋洗，最后用60%甲醇溶液(含40 mmol/L 鹽酸)0.4 ml洗脫。收集洗脫液渦旋5 s，HPLC進樣20 μl。

1.6.2液質(zhì)聯(lián)用進樣樣品上述固相萃取洗脫液進樣5 μl。收集患者樣品HPLC進樣10～11 min的洗脫液(即MTX代謝物收集液)，混勻后進樣5 μl分析，并與固相萃取洗脫液的質(zhì)譜分析結(jié)果進行比較。

2結(jié)果

2.1特異性MTX和內(nèi)標(biāo)在本實驗條件下保留時間分別為8.5和9.4 min。取6份不同來源的健康人空白血漿、空白血漿標(biāo)準(zhǔn)添加樣品和實測樣品，按“1.6.1”項下操作后進樣分析，色譜圖顯示血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)均不干擾MTX和內(nèi)標(biāo)的測定，實測樣品的MTX、內(nèi)標(biāo)和血漿樣品中其他物質(zhì)的色譜峰分離完全(圖1)。

圖1　人血漿中MTX的HPLC色譜圖 A.空白血漿; B.空白血漿加MTX(1.00 μmol/L);C.患者用藥48 h的實測血漿樣品(1.26 μmol/L)；1.MTX；2.內(nèi)標(biāo)；3.7-OH MTX

2.2線性范圍與最低定量限濃度為0.05、0.10、0.25、1.00、2.50、10、25、100 μmol/L的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“1.6.1”項下處理，經(jīng)HPLC分析后，以MTX與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積之比(Y)對相應(yīng)的濃度(X，μmol/L)進行線性加權(quán)(1/X2)回歸，線性回歸方程為：Y=0.278 5X-0.000 059，r=0.999 2。結(jié)果表明，MTX濃度在0.05 ～ 100 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.05 μmol/L。

2.3回收率

2.3.1提取回收率取濃度為0.10、1.00、8.00、80.0 μmol/L的質(zhì)控血漿樣品平行制備5份，按“1.6.1”項下處理后進樣測定。另直接用60%甲醇溶液(含40 mmol/L 鹽酸)配制相應(yīng)濃度的MTX溶液，進樣20 μl，以質(zhì)控樣品與相應(yīng)濃度MTX溶液的色譜峰面積之比，計算提取回收率，結(jié)果見表2。以同法測算內(nèi)標(biāo)回收率為93.2%。

2.3.2方法回收率4個濃度的質(zhì)控樣品平行制備5份，按“1.6.1”項下操作后進樣測定，所得的MTX與內(nèi)標(biāo)的峰面積比以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，測得濃度與相應(yīng)配制濃度的比值即為方法回收率，結(jié)果見表2。

表2　MTX血漿樣品的提取回收率和方法回收率( n=5)

2.4精密度4個濃度的質(zhì)控樣品平行制備5份，按“1.6.1”項下操作后測定，連續(xù)3 d同法處理進樣，考察日內(nèi)與日間精密度，結(jié)果表明本測定方法精密度良好(表3)。

表3　血漿樣品中MTX濃度測定的精密度( n=5)

2.5穩(wěn)定性

2.5.1樣品的室溫穩(wěn)定性取濃度為0.10、1.00、8.00、80.0 μmol/L的質(zhì)控血漿樣品，在室溫25 ℃下放置4 h后測定其濃度，結(jié)果與其理論濃度偏差<8.2%，RSD<7.2%，表明MTX于室溫條件下4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.2樣品的凍融穩(wěn)定性各濃度的質(zhì)控血漿樣品，反復(fù)凍融3次，每次凍融后分別測定，測得各凍融批次間樣品的濃度變化<7.3%，RSD<7.8%，表明MTX血漿樣品反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性良好。

2.5.3樣品在自動進樣器中的穩(wěn)定性將各濃度的質(zhì)控樣品按“1.6.1”項下處理后立即進樣，并在自動進樣器中放置24 h后再次進樣，比較前后兩次進樣測定濃度變化<4.3%，RSD<6.0%，表明MTX血漿樣品經(jīng)前處理后24 h內(nèi)在自動進樣器中穩(wěn)定。

2.5.4樣品存放期的穩(wěn)定性將各濃度的質(zhì)控血漿樣品，在-40 ℃冰箱內(nèi)存放3個月后測定其濃度，結(jié)果與其理論濃度偏差<8.7%，RSD<5.9%，證明MTX血漿樣品在-40 ℃冰箱內(nèi)存放3個月穩(wěn)定性良好。

2.6稀釋試驗由于在臨床治療過程中，患者的MTX血藥濃度值可能超過100 μmol/L，即超出本研究的定量上限，必須經(jīng)過稀釋后才能測定。用空白血漿將含1 000 μmol/L MTX的樣品稀釋20倍后測定，測得濃度乘20后與實際配制濃度比較，質(zhì)控樣品經(jīng)過稀釋后的準(zhǔn)確度為101%，RSD<2.7%。

2.7臨床應(yīng)用本方法已應(yīng)用于數(shù)百例使用大劑量MTX化療患者的血藥濃度監(jiān)測。分析結(jié)果顯示，MTX標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的重現(xiàn)性良好，患者血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)、代謝物及合并用藥均不干擾待測物峰。絕大多數(shù)患者在72 h的血藥濃度已低于0.05 μmol/L，少數(shù)血藥濃度不能下降至安全范圍的患者在及時加大解救劑量和頻率后血藥濃度也降低至安全范圍，均未發(fā)生不可逆的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

2.8代謝物鑒定固相萃取處理后的血漿樣品經(jīng)質(zhì)譜全掃描可見m/z為455和471的離子，分別與MTX及其代謝物7-OH MTX的質(zhì)荷比相吻合。根據(jù)文獻報道[12,13]，設(shè)置m/z455→308(MTX)及m/z471→324(7-OH MTX)的多反應(yīng)監(jiān)測，并對兩組質(zhì)荷比通道中的色譜峰進行IDA-EPI掃描，發(fā)現(xiàn)m/z471→324的通道中有色譜峰的保留時間為3.1 min，該物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子為m/z471，主要的特征性碎片離子為m/z342、324、191，分別與MTX的準(zhǔn)分子離子m/z455，特征性碎片離子m/z326、308、175各相差16(圖2)，證明兩者在質(zhì)譜中的碎裂方式相同(圖3)。根據(jù)MTX的分子結(jié)構(gòu)以及兩者各碎片離子質(zhì)荷比的差值均為16，推測前者在MTX的分子結(jié)構(gòu)上發(fā)生了羥基取代，且取代位置為7號位，故推斷其為MTX的代謝物7-OH MTX。MTX代謝物收集液通過液質(zhì)聯(lián)用進樣后，在m/z471→324通道中色譜保留時間也為3.1 min，并在質(zhì)譜中產(chǎn)生m/z324、191的碎片離子，證明在HPLC中保留時間為10.4 min的物質(zhì)確為7-OH MTX。

圖2　人血漿中MTX的HPLC色譜圖MTX與7-OH MTX二級質(zhì)譜圖

圖3　MTX與7-OH MTX的裂解模式

3討論

3.1樣品預(yù)處理HPLC色譜法測定生物樣品中MTX，主要受樣品預(yù)處理方法的限制，文獻報道的蛋白沉淀[3-5]、液液萃取[6, 7]等方法均存在內(nèi)源性雜質(zhì)去除不完全而干擾待測物的測定、色譜柱污染嚴(yán)重、回收率低等問題[9,10]。本方法采用固相萃取法，基本去除了血漿樣品中的基質(zhì)干擾，方法特異性高，回收率達95%以上，重現(xiàn)性好，且省去了吹干復(fù)溶的步驟，操作簡便迅速。

3.2固相萃取柱的選擇本研究比較了Bond Elut C18、FOCUS、Bond Elut SAX和Bond Elut Plexa PCX等固相萃取柱的提取效率，結(jié)果顯示Bond Elut C18柱回收率最高。經(jīng)試驗FOCUS柱洗脫液中MTX回收率略低于Bond Elut C18柱，極性雜質(zhì)較C18柱多；離子交換柱(Bond Elut SAX、Bond Elut Plexa PCX)在保留、淋洗和洗脫的過程中均需調(diào)節(jié)pH值，且需預(yù)先去除血漿中競爭吸附的雜質(zhì)方可載樣，操作較為煩瑣。

3.3內(nèi)標(biāo)的選擇本實驗考察了甲硝唑、茶堿、氨苯甲酸、安定、磺胺、對氨基苯乙酮、對氨基苯乙醚等化合物。結(jié)果表明，氨苯甲酸、安定、磺胺和對氨基苯乙醚的色譜保留時間與MTX差異較大，茶堿在紫外306 nm處吸收不佳，而甲硝唑在固相萃取過程中回收率較低。最后選擇對氨基苯乙酮，其固相萃取的回收率較高，色譜保留時間與MTX相近但不干擾，且在紫外線檢測波長306 nm處有較大吸收，適合作為MTX測定的內(nèi)標(biāo)化合物。

3.4樣品濃縮由于臨床上以用藥72 h MTX濃度低于0.1 μmol/L為安全范圍[1,2]，所以MTX濃度的定量限應(yīng)低于0.1 μmol/L。目前報道的固相萃取方法[8-11]，均需吹干復(fù)溶進行濃縮方能夠達到預(yù)期的定量限，此過程非常耗時。本研究通過減少固相萃取過程中洗脫液的用量，直接完成樣品的濃縮。經(jīng)試驗在洗脫過程中使用不同體積的洗脫液(分別為0.2、 0.3、0.4、 0.5、0.7和1.0 ml)，MTX的回收率分別為97.9%、99.3%、99.5%、99.1%、97.3%和99.0%，無明顯差異，提示以少量洗脫液可同時完成洗脫和濃縮的過程，省去吹干復(fù)溶的操作，從而提高樣品前處理的效率。

3.5質(zhì)譜定性在定量分析過程中，對比空白加樣血漿與患者血漿樣品的液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)10.4 min時出現(xiàn)一色譜峰，見圖1C，推測其或為MTX代謝物的色譜峰。由于實驗室沒有MTX代謝物的對照品，僅依靠HPLC無法確定此色譜峰的物質(zhì)屬性。API 3200 QTRAP是串聯(lián)四級桿-線性離子阱質(zhì)譜儀，其Q3可作為線性離子阱使用，在MRM掃描同時進行增強二級碎片的全譜定性。本研究采用MRM-IDA-EPI 組合掃描模式，

從患者用藥后的血

漿樣品中篩選出主要代謝物7-OH MTX，并獲得液質(zhì)聯(lián)用的相關(guān)特征信息。經(jīng)比較，色譜峰10.4 min處的物質(zhì)在液質(zhì)聯(lián)用中的色譜與質(zhì)譜行為與篩選所得7-OH MTX均相符，故確證其為MTX在人體內(nèi)的代謝物7-OH MTX。

【參考文獻】

[1]Green MR，Chowdhary S，Lombardi KM，etal.Clinical utility and pharmacology of high-dose MTX in the treatment of primary CNS lymphoma[J].Expert Rev Neurother，2006，6(5)：635-652.

[2]Lennard L.Therapeutic drug monitoring of antimetabolic cytotoxic drugs[J].Br J Clin Pharmacol，1999，47：131-143.

[3]彭波.高效液相色譜法測定甲氨蝶呤的血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011, 31 (11)：951-952.

[4]張春燕，顧健.反相高效液相色譜法同時測定人血漿中亞葉酸、5-甲基四氫葉酸及甲氨蝶呤的濃度及臨床應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，2010，45(7)：543-547.

[5]許耘川，袁向亮，沈立松.HPLC法測定血清甲氨蝶呤濃度的方法建立及其與熒光偏振法的比較[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25(9)：701-704.

[6]謝軍平，馮玲玲，匡霞.HPLC 測定大劑量甲氨蝶呤患者血藥濃度[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(11):69-72.

[7]霍晶，袁盛華，方蕓，等.反相高效液相色譜法測定人血漿中甲氨蝶呤的濃度[J].藥學(xué)與臨床研究，2007，15(5)：390-392.

[8]Turci R，Micoli G，Minoia C.Determination of methotrexate in environmental samples by solid phase extraction and high performance liquid chromatography: ultraviolet or tandem mass spectrometry detection?[J].Rapid Commun Mass Spectr，2000，14：685-691.

[9]周卿，潘雪君.固相萃取-高效液相色譜法測定人乳中甲氨蝶呤的含量[J].藥物分析雜志，2011，31(12)：2305-2307.

[10]吳雪梅, 丘宏強, 方令平, 等.固相萃取-高效液相色譜法測定甲氨蝶呤的血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(18)：1617-1619.

[11]張華年，文玲莉，張少文, 等.固相萃取高效液相色譜法檢測生物樣本中甲氨喋呤[J].藥物分析雜志，2000，20(6)：401-404.

[12]曹一辰，孟祥樂，朱金輝，等.LC-MS/MS法測定人血清中甲氨蝶呤及其代謝產(chǎn)物7-羥基甲氨蝶呤的濃度[J].中國藥師，2012，15(2)：191-194.

[13]Guo PI, Wang XM, Liu LS,etal.Determination of methotrexate and its major metabolite 7-hydroxymethotrexate in mouse plasma and brain tissue by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2007，43:1789-1795.

[本文編輯]李睿旻