鄭雪峰，聶焱，黃樞，林燕萍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院，福建福州350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004）

實(shí)驗(yàn)研究

電針督脈穴對去卵巢大鼠骨組織的保護(hù)作用研究

鄭雪峰1，聶焱2，黃樞3，林燕萍1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院，福建福州350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004）

目的研究電針督脈穴對去卵巢大鼠骨組織的保護(hù)作用。方法6月齡SPF級SD雌性大鼠30只，隨機(jī)分成造模組（20只）和假手術(shù)組（10只）。造模組大鼠術(shù)后3個(gè)月，抽簽法隨機(jī)分為模型組、電針督脈治療組，各10只。電針3個(gè)月后，雙能X線骨密度儀測定各組大鼠全身骨密度（BMD），三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測左股骨生物力學(xué)的性能，右側(cè)股骨HE染色做組織形態(tài)學(xué)分析。結(jié)果治療組治療后骨密度均明顯增加，大鼠骨生物力學(xué)性能最大載荷和斷裂載荷值均增高，骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)中骨小梁結(jié)構(gòu)、排列有序，寬度增加，無明顯骨小梁斷裂，Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th均升高，Tb.Sp降低。結(jié)論電針督脈能夠增加去卵巢大鼠的骨密度，增加大鼠骨生物力學(xué)性能，改善骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松；電針；督脈；穴位；實(shí)驗(yàn)研究

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指因卵巢功能衰退，雌激素水平降低等多種原因共同導(dǎo)致的單位體積內(nèi)骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變的代謝性骨?。?］。目前PMOP居于常見病、多發(fā)病中的第七位，現(xiàn)在患病人數(shù)已超過2億。隨著世界人口老齡化的進(jìn)程加速，預(yù)計(jì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病率會繼續(xù)上升，其帶給社會和家庭的危害也將日益嚴(yán)重。目前，藥物治療仍是國內(nèi)外治療PMOP的最主要手段，但長期持續(xù)應(yīng)用，大多數(shù)都有一定的毒副作用［2］。近年來針灸治療骨質(zhì)疏松癥的方法越來越豐富，已從傳統(tǒng)的針刺、艾灸、天灸、耳針、穴位敷貼等發(fā)展到了現(xiàn)代的電針、穴位注射、紅外灸療儀等等，針灸治療骨質(zhì)疏松癥的方法與療效已逐漸被臨床所驗(yàn)證［3-5］。本研究在前期針灸治療PMOP臨床療效觀察基礎(chǔ)上，通過建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察電針對去卵巢大鼠的骨密度、生物力學(xué)性能及骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料華佗牌一次性不銹鋼針（中國蘇州醫(yī)療儀器廠，規(guī)格：直徑為0.30 mm，長度為25 mm）；SPF級6月齡雌性SD大鼠30只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供）；戊巴比妥鈉粉末（美國sigma公司）；

1.2 方法

1.2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型的建立造模組：大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，主要步驟如下：采用2%戊巴比妥鈉（2 mL／kg）麻醉后，消毒手術(shù)區(qū)域，切開腹腔，找到“Y”形子宮后，沿子宮探及子宮末端左右兩側(cè)卵巢，行完全結(jié)扎切除術(shù)。逐層縫合后，肌注青霉素（8萬μ／只）。根據(jù)課題組前期大量的動物造模實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，按照此方法造模，可以建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型。假手術(shù)組：打開腹腔找到雙側(cè)卵巢，但不切除，而是切除卵巢周圍同等體積大小的脂肪組織，其余操作同造模組。

1.2.2 動物分組及干預(yù)

1.2.2.1 動物分組6月齡SPF級SD雌性大鼠30只，隨機(jī)分成造模組20只和假手術(shù)組10只。造模組大鼠術(shù)后3個(gè)月，抽簽法隨機(jī)分為2組：即模型組10只、電針督脈治療組10只（下稱治療組）。

1.2.2.2 動物干預(yù)假手術(shù)組不給任何治療措施，模型組造模后，不給任何治療措施。治療組具體治療方法如下：①取穴：命門、脊中（參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》實(shí)驗(yàn)動物常用腧穴簡圖［6］）；②操作方法：a.電針操作：于每天上午8∶00-10∶00，常規(guī)消毒后，將針呈90°刺入上述穴位皮下達(dá)脊間韌帶層后，不行任何提插、捻轉(zhuǎn)手法；b.“脊中”穴接治療儀正極，“命門”穴接治療儀負(fù)極；c.電針刺激參數(shù)：采用HAN ACYTENS韓氏電針治療儀（WQ-1002F），輸出參數(shù)：疏密波，頻率2／100 Hz（電針頻率為2 Hz時(shí)為方型波，持續(xù)3 s，100 Hz時(shí)為方型波，持續(xù)3 s，電針儀自動在2 Hz和100 Hz之間交替轉(zhuǎn)換）。電針強(qiáng)度以小鼠肢體微顫為度。電針持續(xù)時(shí)間20 min／（只／次），每日1次，連續(xù)針刺10次為1個(gè)療程，療程間休息5 d，再行下1個(gè)療程。共針刺6個(gè)療程，持續(xù)90 d。

1.2.3 動物取材及標(biāo)本制備干預(yù)結(jié)束后，處死實(shí)驗(yàn)動物，進(jìn)行標(biāo)本采集。各組取材前24 h禁食，但可自由飲水。各組大鼠測定骨密度后，腹主動脈取血，常溫放置1 h后，3 000 r／min離心15 min，取上清液，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?；分離各組大鼠雙側(cè)股骨、L1椎體、L2椎體，仔細(xì)剔除其上軟組織，將右側(cè)股骨標(biāo)記后置于4%多聚甲醛固定；其余骨骼用濕生理鹽水紗布包裹后于－80℃超低溫冰箱冷凍備用。

1.2.4 骨密度檢測大鼠稱重，2%戊巴比妥鈉（40mg／kg）麻醉后，運(yùn)用雙能X線骨密度儀提供的小動物骨密度測定軟件，測定大鼠全身骨密度。測量時(shí)要確保被測大鼠四肢處于外展位，防止骨骼在掃描窗內(nèi)重疊。

1.2.5 骨生物力學(xué)檢測將各組大鼠左側(cè)股骨從－80℃冰箱中取出，立即置于37℃水浴，保持生理鹽水濕潤；復(fù)溫后，采用三點(diǎn)彎曲法測定骨生物力學(xué)大小，主要步驟如下：將標(biāo)本放置于島津萬能材料試驗(yàn)機(jī)上，各個(gè)股骨統(tǒng)一按照股骨頭凹面朝下、股骨頭端朝前的位置放置，壓頭在股骨中間位置正上方，調(diào)節(jié)壓頭至其最接近股骨的位置但不觸碰到股骨。儀器設(shè)定：跨距24 mm，壓力加載速度1 mm／min，加壓直至股骨斷裂。通過計(jì)算機(jī)分析得出生物力學(xué)指標(biāo)：最大載荷和斷裂載荷值。最大載荷：股骨斷裂前所能承受的最大力；斷裂載荷：股骨斷裂時(shí)所承受的力。

1.2.6 光鏡觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化右側(cè)股骨標(biāo)記后置于4%多聚甲醛固定，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色，在光鏡10×4倍視野下每個(gè)病理片拍3張，運(yùn)用病理圖像分析系統(tǒng)（Leica CW4000）對骨組織每張病理照片先用全自動圖像分析系統(tǒng)直接測出，再運(yùn)用國際通用的公式計(jì)算測出的參數(shù)：骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量和骨小梁分離度，觀察病理形態(tài)學(xué)變化，最后取其平均值。靜態(tài)參數(shù)計(jì)算方法見表1，計(jì)算公式見表2。

表1 靜態(tài)參數(shù)參數(shù)、單位及測量方法

表2 靜態(tài)參數(shù)計(jì)算公式

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行分析。2組比較使用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電針對去卵巢大鼠骨密度影響結(jié)果如圖1。

圖1 電針對PMOP大鼠骨密度的影響

2.2 電針對PMOP大鼠骨生物力學(xué)的影響見圖2。

2.3 電針對PMOP大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響假手術(shù)組中骨小梁豐富，結(jié)構(gòu)完整，骨小梁數(shù)目多，骨小梁寬度較寬，連接緊密，未見骨小梁斷裂（圖3 A）；而模型組骨小梁開始出現(xiàn)稀疏，骨小梁之間出現(xiàn)斷裂，骨小梁寬度變窄（圖3 B）；經(jīng)過電針督脈治療后，治療組可見較完整的骨小梁結(jié)構(gòu)，骨小梁排列有序，寬度增加，無明顯骨小梁斷裂（圖3 C）。

圖2 電針對PMOP大鼠最大載荷、斷裂載荷的影響

圖3 HE染色觀察各組骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（40×）

與假手術(shù)組比較，模型組骨小梁面積（Tb.Ar）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均降低，骨小梁分離度（Tb.Sp）升高；與模型組比較，治療組Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th均升高，Tb.Sp降低，見圖4。

圖4 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)變化

3 討論

3.1 電針對PMOP大鼠骨密度影響骨密度測量部位選擇主要是根據(jù)目前臨床上雙能X線測定方法最常用部位確定的，股骨近段和腰椎（L1～L4或L2～L4）是研究和測量骨量、骨密度的主要骨骼區(qū)域，因其測量的敏感性和準(zhǔn)確性較高［7］。研究也發(fā)現(xiàn)：雌性大鼠整體BMD與在體和離體L3～6的BMD具有較好的一致性［8］。所以本實(shí)驗(yàn)采用全身骨密度的測定來反映骨丟失情況。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組動物骨密度明顯低于假手術(shù)組，P＜0.05說明動物造模是成功的；治療組骨密度均明顯增加，與模型組比較，具有顯著性差異，說明電針督脈對PMOP具有治療作用。

3.2 電針對PMOP大鼠骨生物力學(xué)影響骨生物力學(xué)研究骨組織在外界作用下的力學(xué)特性和骨在受力后的生物學(xué)效應(yīng)，是評價(jià)骨質(zhì)量最有說服力的指標(biāo)之一。骨礦含量的增加，骨質(zhì)量并不一定相應(yīng)增加，有時(shí)反而降低，因此，進(jìn)行骨生物力學(xué)研究是評定骨質(zhì)量和抗骨丟失療效的最佳方法。朱慧鋒等學(xué)者［9］提出OP發(fā)生時(shí)骨量減少與骨結(jié)構(gòu)改變，均可直接影響骨的生物力學(xué)特性，降低骨的力學(xué)強(qiáng)度。因此，骨生物力學(xué)性能的改變，可作為評價(jià)骨OP及治療有效性的一個(gè)重要指標(biāo)。研究［10-12］發(fā)現(xiàn)：最大載荷和斷裂載荷直接反映松質(zhì)骨骨小梁的骨質(zhì)、結(jié)構(gòu)的連系性、皮質(zhì)骨的強(qiáng)度、骨的橫截面積的大小等，是對骨質(zhì)量的綜合反映。

為進(jìn)一步證實(shí)電針對PMOP的治療作用，本研究同時(shí)觀察了電針對PMOP大鼠骨生物力學(xué)性能的影響，研究結(jié)果表明：與假手術(shù)組比較，模型組最大載荷和斷裂載荷值降低，說明模型的復(fù)制是成功的；與模型組比較，治療組最大載荷和斷裂載荷值均增高，進(jìn)一步證實(shí)電針督脈對PMOP有積極的治療作用。

3.3 電針對PMOP大鼠骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)影響骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)［13］屬體視學(xué)、生物醫(yī)學(xué)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)中的一個(gè)特殊分支。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)包括靜態(tài)參數(shù)與動態(tài)參數(shù)，分別用于不同情況的評價(jià)。該方法主要包括以下三方面內(nèi)容：①可以用形態(tài)學(xué)定性地描述骨組織結(jié)構(gòu)改變；②靜態(tài)學(xué)參數(shù)主要反映骨組織結(jié)構(gòu)的靜態(tài)情況，定量地計(jì)算出骨小梁面積、骨小梁厚度、骨小梁間距、骨小梁數(shù)目等靜態(tài)學(xué)參數(shù)；③動態(tài)參數(shù)主要反映骨形成與骨吸收過程的動態(tài)變化過程。通過活體四環(huán)素標(biāo)記，將四環(huán)素與骨特異結(jié)合并沉積于骨，從而把時(shí)間因素標(biāo)記在骨的重建過程中。

本項(xiàng)目完成骨靜態(tài)計(jì)量學(xué)方面的研究，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組骨小梁豐富，結(jié)構(gòu)完整，數(shù)目較多，寬度較寬，連接緊密，少量空骨陷窩，未見骨小梁斷裂；與假手術(shù)組比較，模型組骨小梁開始出現(xiàn)稀疏，骨小梁之間出現(xiàn)斷裂，寬度變窄，出現(xiàn)較多空骨陷窩，骨小梁面積（Tb.Ar）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均降低，骨小梁分離度（Tb.Sp）升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)過電針督脈后，治療組可見較完整的骨小梁結(jié)構(gòu)、排列有序、寬度增加，較少出現(xiàn)空骨陷窩，無明顯骨小梁斷裂，Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th均升高，Tb.Sp降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明電針督脈對PMOP均有治療作用。

［1］SEIFERT-KLAUSS V，F(xiàn)ILLENBERG S，Schneider H，et al.Bone loss in premenopausal，perimenopausal and postmenopausal women：results of a prospective observational study over 9 years［J］. Climacteric，2012，15（5）：433-434.

［2］SIRID E S，SELBY P L，SAAG K G，et al.Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe［J］.Am J Med，2009，122（2 suppl）：S3-13.

［3］劉獻(xiàn)祥，吳明霞，吳炳煌，等.針灸對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥影響的實(shí)驗(yàn)和臨床研究［J］.中國骨傷，2000，13（9）：519-521.

［4］周曉莉，劉品莉，姜青松，等.“雙固一通”針法治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床研究［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2008，14（3）：204-207.

［5］周曉莉.“雙固一通針法”對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的臨床研究［D］.武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院，2005.

［6］WHO.Technical Report Series No.921.Prevention and management of osteoporosis［S］.Geneva：WHO，2003.

［7］閏景龍，戴克戎，趙雅君，等.卵巢切除對大鼠皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的影響［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志,2001，7（1）：22-25.

［8］潘芳芳，周志華，王永平，等.針?biāo)幉⒂脤^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清E2、骨密度的影響［J］.上海針灸雜志,2012，31（6）：444-446.

［9］張娜，廖二元，王聞博，等.雌性大鼠全身骨密度與腰椎骨密度的一致性研究［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2002，18（2）：120-122.

［10］朱慧鋒，程金海，王珠美，等.去卵巢大鼠干預(yù)后骨生物力學(xué)研究［J］.中醫(yī)正骨，2009，21（8）：5-7.

［11］陳夢詩，賴勝祥，李良，等.大鼠的骨生物力學(xué)指標(biāo)選取及測試［J］.生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2001，18（4）：547-551.

［12］史念珂，富東慧，蔡霞.大鼠骨生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津大學(xué)學(xué)報(bào),2006，39（4）：458-462.

［13］DALLE CARBONARE L，VALENTI M T，BERTOLDO F，et al.Bone microarchitecture evaluated by histomorphometry［J］. Micron，2005,36（7/8）：609-616.

R245-0

A

1000-338X（2015）04-0040-03

2015-06-15

鄭雪峰（1975-），男，副教授。主要從事骨質(zhì)疏松癥的中西醫(yī)基礎(chǔ)和臨床研究。