聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制劑AG014699 提高BRCA2缺陷的胰腺癌細(xì)胞放射敏感性的體外實(shí)驗(yàn)研究

謝建國(guó)鐘睿萬(wàn)愛(ài)萍汪華康恭禮何志堅(jiān)鐘曉鳴

作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院

【摘要】目的探討AG014699提高含BRCA2基因缺陷的胰腺癌細(xì)胞放射敏感性的作用機(jī)制。方法選擇Capan-1和Panc-1 2種胰腺癌細(xì)胞株，分成單純藥物組、單純放療組、藥物聯(lián)合放療組，MTT法檢測(cè)藥物IC50，通過(guò)細(xì)胞克隆形成率分析細(xì)胞存活狀態(tài)，應(yīng)用免疫熒光法觀察H2Ax的形成。結(jié)果單藥AG014699(≤10 μM)對(duì)Capan-1細(xì)胞有毒性作用，對(duì)Panc-1無(wú)效應(yīng)；放療聯(lián)合藥物組對(duì)Capan-1細(xì)胞克隆形成率影響最明顯，與單藥和單放療組比較(P<0.05),而該差異在Panc-1細(xì)胞中不明顯(P>0.05)；DNA損傷表現(xiàn)為H2Ax形式，提示DNA雙鏈斷裂是細(xì)胞死亡的主要模式。結(jié)論AG014699 對(duì)含有BRCA2基因缺陷的胰腺癌細(xì)胞Capan-1有放療增敏作用。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；放射增敏；PARP抑制劑；DNA修復(fù)

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.005

中圖分類號(hào)：R73-36

收稿日期(2015-02-23修回日期 2015-06-17)

Poly(ADP-ribose)Polymerase Inhibitor AG014699 Increase Sensitivity to Radiation in Pancreatic Cancer Cells with BRCA2 Mutation

XIEJianguo,ZHONGRui,WANAiping,etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo investigate radiosensitization mechanism of AG014699 in BRCA2 deficient pancreatic cancer cells.MethodsPancreatic cancer cells lines were used,including Capan-1 with mutuated BRCA-2 and Panc-1 with BRCA1/2 wild type.Cell were treated AG014699 and /or radiotherapy (4～10 Gy) then the capability to proliferate was evaluated by colony formation,cell counting and MTT assays.Flow Cytometry were utilized to assess cell respone to AG014699 plus irradiation.ResultsAG014699 (≤ 10 μM)was cytotoxic to Capan-1 cell with mutuated BRCA-2 but not to Panc-1 cell without BRCA1/2 mutations.AG014699 indued DNA double-strand break in Capan-1 cell.Combination treatment with AG014699 plus radiotherapy was more effective than drug alone.ConclusionThe rationale of using a PARP inhibitor as radiosensitizer in pancreatic cancer with BRCA2 mutation has been demonstrated.

【Key words】Pancreatic cancer;Radiosensitivity;PARP inhibitor;DNA repair

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1439～1442)

胰腺癌是1種早期臨床癥狀不典型、進(jìn)展快及預(yù)后較差的惡性消化腫瘤，由于早期癥狀不明顯,80%以上胰腺癌診斷時(shí)已無(wú)法切除，其中50%～60%為局部晚期胰腺癌[1]。同步放化療是局部晚期胰腺癌的主要治療手段，尤其以健擇為基礎(chǔ)的同步放化療可提高中位生存期[2],但平均中位生存期僅為9～10個(gè)月。因此,尋求新的治療策略對(duì)胰腺癌的臨床治療具有重要意義。而癌細(xì)胞可以通過(guò)PARP酶及同源重組來(lái)修復(fù)基因毒性損傷而引起的單鏈及雙鏈的斷裂。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究觀察PARP抑制劑AG014699能否增加BRCA2缺陷的胰腺癌的放療敏感性，并可能探討其放療增敏的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-1購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。人胰腺癌細(xì)胞PANC-1購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2主要試劑與儀器

Rucaparib(AG-014699)(美國(guó)selleck);RPMI1640、DMEM高糖液體培養(yǎng)基(hyclone)；胎牛血清(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Histone H2AX Antibody(美國(guó)ANBO);熒光標(biāo)記二抗(FITC)羊抗兔IgG、DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；姬姆薩染液(北京索萊寶科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、DMSO(sigma)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將購(gòu)買的已復(fù)蘇的人胰腺癌細(xì)胞Capan-1(含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/L鏈霉素的1640培養(yǎng)液)置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖到80%～90%時(shí)可進(jìn)行消化、離心、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況分別取對(duì)數(shù)期胰腺癌細(xì)胞Capan-1，以10 000個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，過(guò)夜12 h后分別換為含有不同藥物梯度的Rucaparib(AG-014699)(0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、7.5 mmol/L、10.0 mmol/L、20.0 mmol/L、30.0 mmol/L)，并設(shè)置空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組。后置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h，加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清，加入DMSO100 μl/孔。后在水平搖床上搖動(dòng)10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

1.3.3細(xì)胞克隆形成率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)液中備用。對(duì)照組、單純藥物組、單純放療組、放療加藥物組以每皿100、250、500、1 000、1 500、2 000個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種于6cm含培養(yǎng)液的皿中，搖勻并使細(xì)胞分散均勻，含藥組加入10 μmmol/L的Rucaparib(AG-014699)，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物作用6 h后，上述細(xì)胞梯度密度分別照射0、1、2、4、6、8 Gy(采用Elekta 公司Precise 直線加速器，6-MeV 電子線照射，SSD 為100 cm,單次照射，加用0.5cm 硅膠組織補(bǔ)償)，繼續(xù)培養(yǎng)12 天，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，PBS浸洗、甲醇固定、Giemsa染色、流水緩洗染色液、空氣干燥。在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)= 克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4免疫熒光觀察有絲分裂危像取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胰腺癌細(xì)胞，消化、離心并以40 000個(gè)/孔細(xì)胞接種到24孔板中，并加入10 μmmol/L的Rucaparib(AG-014699)，藥物作用6 h后給與放療加藥物組細(xì)胞2 Gy的照射劑量，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,后經(jīng)PBS沖洗、4%多聚甲醛固定、PBS浸洗、0.5%Triton X-100通透20 min，PBS浸洗，正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加足量稀釋好的一抗Histone H2AX Antibody并放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜，次日早上加熒光二抗(FITC)羊抗兔IgG，濕盒中20 ℃～37 ℃孵育1 h,滴加DAPI避光孵育5 min，后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPASS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示計(jì)量資料，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1MTT結(jié)果

在不同時(shí)間點(diǎn)24 h、48 h、72 h對(duì)2種胰腺癌細(xì)胞給予不同藥物濃度的Rucaparib(AG-014699)藥物，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CAPAN隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而細(xì)胞增殖抑制增強(qiáng)，細(xì)胞CAPAN-1在48 h細(xì)胞增殖抑制較明顯，其IC50值為10 μmol/L，見(jiàn)圖1。

圖1　不同藥物濃度及作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖抑制影響

2.2細(xì)胞克隆分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

放療聯(lián)合藥物組對(duì)胰腺癌細(xì)胞Capan-1細(xì)胞克隆形成率影響最明顯，與單藥和單放療組比較(P<0.05),細(xì)胞CAPAN-1通過(guò)細(xì)胞克隆分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑可增強(qiáng)放射治療的敏感性。

2.3細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

單純放療(2 Gy)和藥物聯(lián)合照射(2 Gy)24 h后,藥物聯(lián)合放療組細(xì)胞有絲分裂危象較單純放療組增加(P<0.05)。

3討論

胰腺癌是臨床常見(jiàn)的1種消化道惡性腫瘤，預(yù)后也較差，由于胰腺癌位于腹膜后，位置較深，早期臨床癥狀比較隱匿，臨床診斷和治療也較為棘手，大部分患者診斷時(shí)已為局部晚期而喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，5年總生存率不足5%。放射治療是胰腺癌綜合治療中的重要方法之一，可增加手術(shù)切除的可能，并改善患者預(yù)后。臨床上胰腺癌患者對(duì)放射治療的敏感性存在差異，與其自身生物學(xué)特點(diǎn)有關(guān)。胰腺癌是低血供腫瘤，乏氧環(huán)境生長(zhǎng)，對(duì)放射治療不敏感，而提高放療劑量將引起相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率的增加，少數(shù)患者可引起治療中斷[3]。臨床上多采用多種藥物聯(lián)合放療以提高其放療敏感性。

放射治療是通過(guò)電離輻射至DNA 雙鏈斷裂而引起致死性損傷事件，其作用靶點(diǎn)是DNA 鏈，有些細(xì)胞受照射后DNA 單鏈斷裂，后通過(guò)多種DNA 修復(fù)途徑復(fù)活,故凡能抑制DNA 損傷修復(fù)的藥物，均有可能使單鏈斷裂發(fā)展至雙鏈斷裂，從而提高放射治療的殺傷效應(yīng)，即放射增敏劑。1946年，遺傳學(xué)家Dobzhansky 等[4]首次提出“合成致死”理論：兩種非致死的遺傳變異單獨(dú)發(fā)生時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)影響，但同時(shí)發(fā)生在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可致細(xì)胞死亡。利用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制劑治療含BRCA1/BRCA2 突變體腫瘤的“合成致死”模式是目前國(guó)際上該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-6]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的一個(gè)多功能蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶。PARP 家族由18種蛋白酶組成，分別參與DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定遺傳、細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡等多種生物學(xué)功能[7]。BRCA1/BRCA2 基因編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞通路和DNA損傷修復(fù)等功能。BRCA1可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和發(fā)現(xiàn)DNA 修復(fù)并募集修復(fù)酶；而BRCA2 直接將DNA 修復(fù)蛋白R(shí)AD51直接易位到DNA損傷區(qū)域進(jìn)行修復(fù)[8-9]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)胰腺癌，尤其是家族性胰腺癌，多數(shù)攜帶BRCA2 突變基因[10-12],位于乳腺癌和卵巢癌之后。PARP抑制劑是與DNA 損傷修復(fù)有關(guān)的一類小分子靶向藥物，是否能提高放射治療的敏感性呢？Khan 等[13]探索PARP抑制劑GPI-15427 聯(lián)合放療的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)GPI-15427 可提高頭頸部鱗狀細(xì)胞癌JHU006 和JHU012 的放射敏感性，DNA雙鏈斷裂明顯增多。Efimova 等[14]發(fā)現(xiàn)PARP 抑制劑ABT-888 聯(lián)合放療可延長(zhǎng)放療對(duì)BRCA1/BRCA2 缺陷的乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，并加速細(xì)胞衰老。Kaye 等[15]開(kāi)展一項(xiàng)多中心、開(kāi)放式的隨機(jī)II 期臨床研究，比較PARP 抑制劑AZD2281 和阿霉素脂質(zhì)體對(duì)卵巢癌的療效，97例復(fù)發(fā)或證實(shí)有BRCA1/2 突變的卵巢癌入組，結(jié)果顯示口服AZD2281 200 mg/次和400 mg/次，每天2 次的患者與阿霉素組相比，無(wú)進(jìn)展生存率(PFS)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異，而400mg/次的AZD2281 組的藥物毒性可耐受，提示AZD2281 是1種低毒高效型的藥物。Jacob 等[16]比較PARP 抑制劑3-ABA 聯(lián)合化療藥物健擇與單獨(dú)健擇對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞毒性更大，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤體積縮小，小鼠存活時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)40 天以上。Gottipati 等[17]發(fā)現(xiàn)PARP 抑制劑對(duì)BRCA2 缺陷的胰腺癌細(xì)胞系CAPAN-1 有較強(qiáng)的抑制作用。Letizia 等[18]比較PARP抑制劑聯(lián)合放療較單純放療作用于胰腺癌細(xì)胞CAPAN-1，通過(guò)細(xì)胞克隆分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑可提高放療的敏感性，其聯(lián)合放化療較放化療可增加胰腺癌CAPAN-1、MiapaCa-2、AsPC-1、Panc-1細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)。

本次研究結(jié)果顯示：不同時(shí)間點(diǎn)24 h、48 h、72 h對(duì)兩種胰腺癌細(xì)胞CAPAN-1給予不同藥物梯度的Rucaparib(AG-014699)藥物，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CAPAN隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而細(xì)胞增殖抑制增強(qiáng)，測(cè)得細(xì)胞CAPAN-1在48時(shí)細(xì)胞增殖抑制較明顯，其IC50值在10 μmol/L值。胰腺癌細(xì)胞CAPAN-1通過(guò)細(xì)胞克隆分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑可增加放射治療的敏感性。單純放療(2 Gy)和藥物聯(lián)合照射(2 Gy)后24 h,藥物加放療組中細(xì)胞有絲分裂危象較單純放療增加，與上述Letizia P等學(xué)者研究相一致[18]。

綜上所述，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制劑AG014699可提高BRCA2缺陷的胰腺癌細(xì)胞放射敏感性，值得更多基礎(chǔ)研究，進(jìn)一步推廣及應(yīng)用到臨床中。

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(編輯：吳小紅)