（湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北恩施445000）

馬齒莧（purslane）為馬齒莧科一年生草本植物，味酸性寒，具有清熱解毒、涼血止血之功效。馬齒莧水提取物對(duì)氧化自由基有較好的清除作用［1］，能治療手足癬，具有抗腫瘤、抗衰老［2－3］的功效，對(duì)紅細(xì)胞膜有保護(hù)作用［4］，具有藥理和營(yíng)養(yǎng)保健作用［5－6］。馬齒莧含有多種化學(xué)成分，大多為有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、香豆素類(lèi)和生物堿類(lèi)［7］，其黃酮類(lèi)化合物［8］多為結(jié)晶性固體，少數(shù)（如黃酮苷類(lèi)）為無(wú)定形粉末，溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)（主要是指苷或苷元、糖苷等）不同而有很大差異。馬齒莧總黃酮具有廣泛的生理活性，如保護(hù)心血管系統(tǒng)作用、抗肝臟毒作用、抗炎作用、雌性激素樣作用、瀉下作用、抗病毒作用及解痙作用等。作者以蘆丁為對(duì)照品，采用分光光度法對(duì)馬齒莧中總黃酮進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)馬齒莧中總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；研究了馬齒莧總黃酮的抗氧化活性，并與抗壞血酸（Vc）進(jìn)行了對(duì)比。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

馬齒莧購(gòu)于恩施宏升大藥房，干燥后置于中藥中速粉碎機(jī)中粉碎，經(jīng)無(wú)水乙醚脫脂處理后放入紅外干燥儀中烘干，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)008029705），中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；所用試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為二次蒸餾水。

Spectrumlab 22pc型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；UV－2550型紫外分光光度儀，日本島津制作所；HH－2S 型恒溫水浴鍋，上海天平儀器廠；DW－2型調(diào)溫電熱器，江蘇通州光學(xué)儀器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，上海華英儀器有限公司；800型離心機(jī)，上海云樓醫(yī)用儀器廠；FA1004B 型電子天平，上海佑科儀器有限公司；RE－52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧中總黃酮的提取

參照文獻(xiàn)［9－10］對(duì)馬齒莧中總黃酮進(jìn)行提取。提取工藝流程如圖1所示。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

以50%乙醇、4%氫氧化鈉為溶劑，以亞硝酸鈉、硝酸鋁為顯色劑，對(duì)蘆丁與顯色劑所配溶液在200～800nm 之間進(jìn)行掃描，測(cè)得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在500nm處有最大吸收峰。因此，選擇500nm 為馬齒莧提取液中總黃酮的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 馬齒莧中總黃酮的提取工藝流程Fig.1 The extraction process of total flavonoids from purslane

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的確定

準(zhǔn)確配制0.200 mg·mL－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，并精確量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0mL于10mL 容量瓶中，分別加入0.3mL 5%的NaNO2，靜置6 min 后加入0.3 mL 10% 的Al2（NO3）3，靜置6min后加入2mL 4%的NaOH 溶液，靜置10min后加入50%的乙醇定容至10mL，放置20min，在500nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［9，11］。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取馬齒莧2.0g于三頸燒瓶中，在設(shè)定條件下回流提取，分別考察提取溶劑種類(lèi)、提取次數(shù)、水浴溫度、提取時(shí)間、固液比對(duì)總黃酮提取率的影響，以確定各因素變化范圍和適應(yīng)值。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、水浴溫度、提取溶劑和固液比為考察因素，以馬齒莧總黃酮提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，以確定馬齒莧中總黃酮的最優(yōu)提取工藝。

1.2.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.5.1 對(duì)羥基自由基（·OH）的清除效果

參照文獻(xiàn)［9］，分別用容量瓶量取1 mg·mL－1的馬齒莧總黃酮提取液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL，依次加入1mL的9.0mmol·L－1FeSO4溶液、9.0mmol·L－1水楊酸乙醇溶液、8.8mmol·L－1H2O2溶液，用蒸餾水稀釋至10mL。在37 ℃水浴反應(yīng)30min后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定510nm 處吸光度（A樣品）?？瞻捉M不加總黃酮提取液，操作同上，測(cè)定其吸光度（A空白），樣底中不加H2O2溶液，測(cè)定其吸光度（A樣底），按式（1）計(jì)算清除率。

用同樣方法配制不同濃度梯度的Vc溶液，測(cè)定吸光度，并與總黃酮的清除效果進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5.2 對(duì)超氧陰離子自由基（·O－2）的清除效果

參照文獻(xiàn)［9］，分別用容量瓶量取1 mg·mL－1的馬齒莧總黃酮提取液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL、2.0mL，加入4.5mL pH 值為8.2的0.05mol·L－1Tris－HCl緩沖溶液，用蒸餾水稀釋到6.0mL。于25 ℃水浴預(yù)熱20min，再加入0.4 mL 6.0 mmol·L－1的鄰苯三酚溶液（含有10mmol·L－1的HCl），在25 ℃水浴反應(yīng)4 min后，加入2滴8.0mol·L－1的HCl終止反應(yīng)，并用蒸餾水稀釋至10mL，測(cè)定420nm 處吸光度（A樣品）?？瞻捉M不加總黃酮提取液，操作同上，測(cè)定吸光度（A空白），用10mol·L－1的HCl代替鄰苯三酚溶液作為樣底，測(cè)定吸光度（A樣底），按式（1）計(jì)算清除率。

用同樣方法配制不同濃度梯度的Vc溶液，測(cè)定吸光度，并與總黃酮的清除效果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of rutin

對(duì)圖2曲線進(jìn)行擬合，得回歸方程為A＝0.949c＋0.0002，R2＝0.9992。表明蘆丁濃度在0.016～0.056mg·mL－1之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)比了回流提取和索氏提取對(duì)提取率的影響。盡管索氏提取提取率稍高，但溶劑消耗量大，后期處理繁瑣。所以，選擇回流提取。

2.2.1 提取溶劑對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響

選用水、乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑，在溶劑用量為100mL、水浴溫度為90 ℃、提取時(shí)間為50min、提取2次的條件下，考察不同濃度提取溶劑對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，乙醇和乙酸乙酯對(duì)馬齒莧總黃酮的提取效果均優(yōu)于水，且30%乙酸乙酯和70%乙醇的提取效果相當(dāng)?？紤]到乙醇溶液廉價(jià)易得，且使用安全、溶解性好，故選擇70%乙醇為提取溶劑。

圖3 不同濃度提取溶劑對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of solvent on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2.2 提取次數(shù)對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在固液比為1∶50、提取時(shí)間為50min、水浴溫度為90 ℃的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate of total flavonoids from purslane

由圖4可知，提取2次的總黃酮提取率較高，但提取次數(shù)過(guò)多，提取率提高并不大，且會(huì)造成溶劑浪費(fèi)和提取液純化困難。因此，提取次數(shù)以2次為宜。

2.2.3 水浴溫度對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇溶液為提取溶劑，在提取時(shí)間為50 min、提取2次的條件下，考察水浴溫度對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，水浴溫度在60～100℃時(shí)，總黃酮提取率隨溫度的升高先升高后降低，在90 ℃時(shí)達(dá)到最高，為5.61mg·g－1。這是因?yàn)?，升高溫度有利于溶劑滲透和擴(kuò)散到組織細(xì)胞中，提取率上升；但溫度過(guò)高易使黃酮類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率下降。因此，水浴溫度以90 ℃左右為宜。

圖5 水浴溫度對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of water temperature on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在水浴溫度為90 ℃、提取2次的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取時(shí)間對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from purslane

由圖6可知，總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先迅速升高后趨于穩(wěn)定，在提取時(shí)間超過(guò)50min后，提取率變化不大。這是因?yàn)?，提取時(shí)間過(guò)短，溶劑未充分滲透到組織細(xì)胞中溶解總黃酮；提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，原料中的總黃酮向溶液中擴(kuò)散的速度與溶液中總黃酮向原料中擴(kuò)散的速度基本達(dá)到平衡，提取率趨于穩(wěn)定。故提取時(shí)間以50min左右為宜。

2.2.5 固液比對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在水浴溫度為90 ℃、提取時(shí)間為50min、提取2 次的條件下，考察固液比對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，固液比在1∶30～1∶50（g∶mL，下同）之間時(shí)，隨溶劑量增大，總黃酮提取率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)固液比為1∶50時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高，為5.61 mg·g－1，隨后總黃酮的提取率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，增加溶劑用量有利于總黃酮由原料向提取液中擴(kuò)散，總黃酮提取率上升；但當(dāng)溶劑量達(dá)到某一值后，提取液與原料表面的總黃酮濃度已達(dá)平衡，溶劑中提取原料的副產(chǎn)物也會(huì)增多，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行［12］。考慮溶劑成本及環(huán)境等因素，固液比以1∶50左右為宜。

圖7 固液比對(duì)馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of solid－liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.3 正交實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.1 Results and analysis of orthogonal experiment

表2 方差分析Tab.2 Results of variance analysis

由表1和表2可知，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小依次為：提取溶劑＞水浴溫度＞固液比＞提取時(shí)間，最佳提取工藝為A2B2C3D2，即提取時(shí)間50 min、水浴溫度90 ℃、提取溶劑為30%乙酸乙酯、固液比1∶50（g∶mL）。

在最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮提取率為7.15mg·g－1。

2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 馬齒莧總黃酮對(duì)·OH 的清除率

Fenton反應(yīng)體系中，雙氧水和亞鐵離子混合后產(chǎn)生·OH，鄰羥基苯甲酸能捕捉·OH 而產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm 處有強(qiáng)吸收。但若往該反應(yīng)體系中加入具有清除·OH 作用的物質(zhì)（如黃酮類(lèi)物質(zhì)等），其在510nm 處的吸收將減弱或消失［9－10］。依據(jù)此原理，考察馬齒莧總黃酮對(duì)·OH 的清除效果，結(jié)果如圖8所示。

圖8 馬齒莧總黃酮對(duì)·OH 清除率的影響Fig.8 Effect of total flavonoids from purslane on scavenging rate of·OH

由圖8可看出，馬齒莧總黃酮和Vc對(duì)·OH 都具有一定的清除能力，均隨濃度增大而提高，但Vc的清除效果明顯好于馬齒莧總黃酮；當(dāng)Vc濃度大于0.06 mg·mL－1時(shí)，清除率變化不大，均超過(guò)92.02%；當(dāng)馬齒莧總黃酮濃度為0.18 mg·mL－1時(shí)，清除率可達(dá)73.12%。雖然馬齒莧總黃酮對(duì)·OH 的清除率沒(méi)有Vc高，但馬齒莧總黃酮為天然抗氧化劑，其安全性相對(duì)較高［9－10，13］。

2.4.2 馬齒莧總黃酮對(duì)·O－2的清除率

鄰苯三酚在pH 值為8.2 時(shí)能夠發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成·O－2和有色中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在420nm 處有強(qiáng)吸收。若抑制·O－2和有色中間產(chǎn)物的生成，其在420nm 處的吸收會(huì)減弱［13］，同時(shí)鄰苯三酚的自氧化也將受阻。依據(jù)此原理，考察馬齒莧總黃酮對(duì)·O－2的清除效果，結(jié)果如圖9所示。

圖9 馬齒莧總黃酮對(duì)·O－2 清除率的影響Fig.9 Effect of total flavonoids from purslane on scavenging rate of·O－2

由圖9可看出：馬齒莧總黃酮和Vc對(duì)·O－2均有清除能力，且隨濃度增大而提高，但Vc的清除效果優(yōu)于馬齒莧總黃酮；當(dāng)Vc濃度大于0.08mg·mL－1時(shí)，清除效果超過(guò)96.02%；馬齒莧總黃酮對(duì)·O－2的清除率隨濃度的增大上升緩慢，當(dāng)濃度為0.20mg·mL－1時(shí)，清除率僅為50.23%，但馬齒莧總黃酮的安全性相對(duì)較高［9－10，13］。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定馬齒莧中總黃酮的最佳提取工藝為：提取時(shí)間50min、水浴溫度90 ℃、提取溶劑為30%乙酸乙酯、固液比1∶50（g∶mL），在此條件下，總黃酮提取率可達(dá)7.15mg·g－1。馬齒莧總黃酮對(duì)·OH 和·O－2均有清除效果，但相同濃度時(shí)Vc清除效果較佳。

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