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        山銀花綠原酸提取方法的比較

        2015-12-28 05:42:20
        化學(xué)與生物工程 2015年4期

        (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中草藥與天然產(chǎn)物研究室,湖南長(zhǎng)沙410128)

        山銀花為常用中藥,具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效[1],同時(shí)山銀花還是重要的化工原料和優(yōu)良飲品原料[2]。山銀花分布廣,在我國(guó)西南、中南地區(qū)有大量栽培[3-5]。湖南邵陽(yáng)、婁底、懷化等地區(qū)的山銀花藥材商品名為“湘銀花”,其產(chǎn)量占全國(guó)山銀花總產(chǎn)量的40%以上。

        作者在此分別采用水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法提取山銀花中的綠原酸,并通過(guò)高效液相色譜測(cè)定綠原酸含量,比較各種方法的提取效果,以期為植物有效成分的提取提供幫助。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 材料、試劑與儀器

        山銀花,湖南省隆回縣小沙江鎮(zhèn)金銀花基地;纖維素酶;綠原酸。

        無(wú)水乙醇、甲醇、磷酸等均為分析純;乙腈為色譜純;蒸餾水。

        KQ3200E型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;THZ-92B 型臺(tái)式恒溫振蕩器,上海浦東物理光學(xué)儀器廠;DK-S24型恒溫水箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;中草藥粉碎機(jī),天津泰斯特儀器有限公司;AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵,鞏義英峪予華儀器廠;R-1001N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;1200型高分離度快速液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 山銀花中綠原酸的提取

        1)水提法

        將山銀花莖于60 ℃恒溫干燥后用中草藥粉碎機(jī)粉碎。精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中,分別用10 倍量、10 倍量、8 倍量的蒸餾水于70 ℃煎煮3次,每次1h。合并煎煮液,抽濾,取濾液于60℃減壓濃縮至干,置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量,得綠原酸粗提物。

        2)醇提法

        精確稱取5g干燥的山銀花粉末于250mL 圓底燒瓶中,加75%乙醇,分別用10 倍量的75%乙醇于80 ℃下加熱回流提取2次,每次1h。合并提取液,抽濾,取濾液于60 ℃減壓濃縮至干,置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量,得綠原酸粗提物。

        3)酶解法

        精確稱取0.5g纖維素酶(2 000IU·g-1)定容于100mL容量瓶中配制成0.5%纖維素酶液。精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100 mL 錐形瓶中,加入10倍量0.5%纖維素酶液處理15 min,迅速高溫滅活,將處理液分別用10倍量60%乙醇和10倍量蒸餾水于80℃加熱回流提取2次,每次1h。合并提取液,抽濾,取濾液于60 ℃減壓濃縮至干,置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量,得綠原酸粗提物。

        4)超聲波法

        精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中,加入12 倍量蒸餾水,在超聲波清洗器中處理0.5h,再分別用10倍量、10倍量、8倍量的蒸餾水于70 ℃煎煮3次,每次1h。合并煎煮液,抽濾,取濾液于60℃減壓濃縮至干,置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量,得綠原酸粗提物。

        5)微波法

        精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中,先用少量乙醇潤(rùn)濕,再加入1.25倍量的75%乙醇,用微波快速汽化處理70s后,用25倍量的90 ℃水洗滌10min,再用水提法提取得綠原酸粗提物。

        1.2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜(圖1)

        圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜Fig.1 The HPLC of chlorogenic acid standard

        HPLC 條件:流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸(23∶77,體積比),流速為1mL·min-1,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)324nm,理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

        1.2.3 綠原酸提取率的測(cè)定

        將綠原酸粗提物置于50mL容量瓶中,用50%甲醇定容,搖勻;再稀釋50 倍,用50%甲醇定容,搖勻;0.45μm 濾膜過(guò)濾,備用。用流動(dòng)相將柱子洗脫干凈后,進(jìn)樣5μL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。取待測(cè)樣品5 μL進(jìn)樣,測(cè)得各樣品的峰面積。根據(jù)標(biāo)樣濃度以及樣品峰和標(biāo)樣峰的面積比可求得各提取液中綠原酸含量,按下式計(jì)算綠原酸提取率:

        2 結(jié)果與討論

        2.1 提取效果比較

        采用5種方法提取山銀花中的綠原酸,比較各方法所得綠原酸含量和提取率,結(jié)果見(jiàn)圖2。

        由圖2可知,酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提高山銀花中綠原酸提取率,其中微波法提取率最高,醇提法提取率最低。具體比較如下:

        (1)水提法提取率為4.51%,醇提法提取率為3.14%,水提法提取率明顯高于醇提法,且相對(duì)于醇提法,水提法藥品消耗量少、步驟簡(jiǎn)單。這是因?yàn)?,綠原酸的水溶性好,易溶于熱水,在25 ℃水中的溶解度約為4%,故水提法提取率高于醇提法。

        圖2 不同方法所得綠原酸含量(a)和提取率(b)比較Fig.2 Comparison of content(a)and extraction rate(b)of chlorogenic acid by different methods

        (2)醇提法和酶解法均是在80℃下用乙醇加熱回流提取2次,醇提法提取率為3.14%,酶解法提取率為4.14%,酶解法提取率明顯高于醇提法。這是因?yàn)椋姐y花用纖維素酶處理后,細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)致密的纖維素水解成水溶性糖類物質(zhì),有利于胞內(nèi)物質(zhì)(綠原酸)溶出,綠原酸提取率相應(yīng)提高。如能控制好酶處理溫度及作用時(shí)間則能大幅提高山銀花中綠原酸提取率。酶解法操作簡(jiǎn)便、提取物純度高、無(wú)有機(jī)溶劑殘留,但生產(chǎn)成本較高,其可行性有待進(jìn)一步研究。

        (3)超聲波法提取率為4.62%。超聲波能擊碎細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)組分滲透到溶液中,從而達(dá)到分離的目的。該法提取率高、綜合成本低、污染小、易過(guò)濾,無(wú)醇提法中因溶劑使用帶來(lái)的不利。但山銀花經(jīng)超聲波處理后呈糊狀黏稠,不利于后續(xù)操作,不適合工業(yè)化生產(chǎn),其可行性有待進(jìn)一步研究。

        (4)微波法提取率為4.69%。與超聲波法相比,微波法不僅提取率高、提取時(shí)間短,且重復(fù)性好,可用于植物有效成分的快速分析,但操作步驟繁瑣,不適宜大量樣品的處理。

        2.2 方差分析(表1,表2)

        表1 5種方法提取率的描述性指標(biāo)Tab.1 The descriptive index of extraction rate by five methods

        表2 5種方法提取率的兩兩比較(LSD法)Tab.2 The binary comparison of extraction rate by five methods(LSD method)

        由表2可知,以LSD 法作均數(shù)進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果為:水提法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異(具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);醇提法與水提法、酶解法、超聲波法、微波法之間存在顯著性差異;酶解法與水提法、醇提法、超聲波法、微波法之間存在顯著性差異;超聲波法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異;微波法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異。

        2.3 討論

        (1)酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提高山銀花中綠原酸提取率,其中提取率最高的是微波法,酶解法和超聲波法也能得到較高的提取率,但只適合提取少量樣品,不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn),其可行性有待進(jìn)一步研究。

        (2)綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,高溫加熱易氧化分解,因此,高溫及長(zhǎng)時(shí)間加熱不利于山銀花中綠原酸的提取。在堿性條件下,綠原酸可發(fā)生水解,在提取純化時(shí)也應(yīng)予以注意。綠原酸分子中含有5個(gè)羥基和1個(gè)羧基,在水中溶解度達(dá)4%,因此,從經(jīng)濟(jì)、適用和安全角度出發(fā),大量提取山銀花中綠原酸時(shí),多以水為溶劑。

        3 結(jié)論

        分別采用水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法提取山銀花中綠原酸,提取率大小依次為:微波法(4.69%)>超聲波法(4.62%)>水提法(4.51%)>酶解法(4.14%)>醇提法(3.14%)??梢钥闯觯核岱?、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提取山銀花中綠原酸,其中微波法提取率最高,醇提法提取率最低。

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