廖乙媚，陳 虹，秦 箐，，莫建赧，劉布鳴，蒙法艷，周朝霞，林翠梧

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004；3.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西南寧530022；4.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530022；5.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530023）

板藍(lán)根來(lái)源于草大青、植物馬藍(lán)、菘藍(lán)的干燥根，是中國(guó)常用的中藥材。可用于預(yù)防感冒、咽喉疼痛等，研究表明板藍(lán)根還具有抗病毒、抗菌、增強(qiáng)免疫功能的作用。在我們前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根與免疫抑制劑聯(lián)用能延長(zhǎng)心臟移植手術(shù)小鼠的生存時(shí)間［1－2］。從板藍(lán)根中提取分離出的水楊酸可廣泛用于治療病毒性和細(xì)菌性感染。水楊酸磺胺類(lèi)似物4－（2－乙酰氧基苯甲酰）氨基磺胺間甲氧嘧啶（類(lèi)似物Ⅰ）、4－（2－羥基苯甲酰）氨基磺胺間甲氧嘧啶（類(lèi)似物Ⅱ）、4－（2－羥基苯甲酰）氨基磺胺二甲嘧啶（類(lèi)似物Ⅲ）、4－（2－乙酰氧基苯甲酰）氨基磺胺二甲嘧啶（類(lèi)似物Ⅳ）是以水楊酸和磺胺為原料合成的新化合物，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 水楊酸磺胺類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of analogue of salicylic acid－sulfonamidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ

血清白蛋白（SA）在哺乳動(dòng)物體內(nèi)起著重要的貯存和運(yùn)輸作用［3］，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合。從不同角度研究其與藥物的相互作用，對(duì)闡明藥物的運(yùn)輸與代謝過(guò)程及了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能起著重要作用［4］。作者以牛血清白蛋白（BSA）與系列水楊酸磺胺類(lèi)似物為研究對(duì)象，建立水楊酸磺胺類(lèi)似物－BSA 的作用體系，采用分子熒光分析法和同步熒光猝滅法研究水楊酸磺胺類(lèi)似物－BSA 作用體系的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及相應(yīng)的熱力學(xué)常數(shù)等，以闡明水楊酸磺胺系列類(lèi)似物在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過(guò)程，為進(jìn)一步的生物學(xué)研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA，98%），合肥博美Sigma分裝；水楊酸磺胺類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，本實(shí)驗(yàn)室合成；二甲基亞砜，BR，廣東光華化學(xué)廠有限公司。

牛血清白蛋白用蒸餾水配制成1×10－4mol·L－1儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存。Tris－HCl緩沖溶液（pH＝7.4，離子濃度0.1mol·L－1）。水楊酸磺胺類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ取適量分別溶于5mL 二甲基亞砜，分別用Tris－HCl緩沖溶液稀釋成1×10－4mol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

RF－5301PC型熒光分光光度計(jì)，日本島津；FE20型精密pH 計(jì)、PB602－N 型電子天平，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；AG245型電子分析天平，瑞士梅特勒公司；DF－101S型集熱式恒溫加熱器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；移液槍?zhuān)虾？迫A系統(tǒng)有限公司。

1.2 方法

分別準(zhǔn)確吸取一定體積的水楊酸磺胺類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液于對(duì)應(yīng)的10 mL 比色管中，加入1mL的BSA 儲(chǔ)備液，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋到10mL。分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃恒溫水浴下，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)λex＝295nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度為快速，靈敏度位高，在發(fā)射波長(zhǎng)λem＝300nm 時(shí)測(cè)定發(fā)射光譜。設(shè)定發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)差為Δλ＝15nm 和Δλ＝60nm，分別掃描系列類(lèi)似物－BSA體系在25 ℃時(shí)的同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 類(lèi)似物－BSA作用體系的熒光猝滅光譜

BSA 由于其自身的色氨酸殘基和酪氨酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源熒光。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下，固定BSA 的量，逐漸增加類(lèi)似物的量，測(cè)定系列類(lèi)似物－BSA 作用體系發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由圖2 可知，系列類(lèi)似物－BSA 作用體系在345 nm 左右有最強(qiáng)峰，且隨著類(lèi)似物濃度的增加，BSA 的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，說(shuō)明系列類(lèi)似物均能與BSA 產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致熒光猝滅反應(yīng)的發(fā)生。

2.2 熒光猝滅機(jī)理的確定

熒光猝滅通?？煞譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［5］，動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過(guò)程，其作用過(guò)程遵循Stern－Volmer方程［6］：

式中：F0和F分別為加入類(lèi)似物前后BSA 的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；KSV為猝滅常數(shù)；τ0為BSA 的平均壽命，10－8s［7］；［Q］為類(lèi)似物分子濃度。

根據(jù)方程（1）可作Stern－Volmer曲線（圖3）及計(jì)算相關(guān)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系在35 ℃時(shí)的熒光猝滅常數(shù)曲線Fig.3 Stern－Volmer curves of fluorescence quenching constants of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at 35 ℃

表1 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系在35 ℃時(shí)的Stern－Volmer猝滅常數(shù)Tab.1 Stern－Volmer quenching constants of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at 35 ℃

由表1可知，系列類(lèi)似物－BSA 作用體系的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq均大于2.0×1010L·mol－1·s－1，動(dòng)態(tài)猝滅中各種猝滅劑和生物分子的最大分散碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，由此可判定類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 相互作用體系的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，故可以忽略在研究的濃度范圍內(nèi)類(lèi)似物－BSA 產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)碰撞。

2.3 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

根據(jù)文獻(xiàn)［9］，對(duì)于靜態(tài)猝滅，熒光猝滅強(qiáng)度與藥物濃度之間的關(guān)系可根據(jù)校正過(guò)的Stern－Volmer方程表示：

式中：Kb為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

根據(jù)雙對(duì)數(shù)回歸曲線方程（2）可求出Kb值、n值及相應(yīng)的R2值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)Tab.2 Binding constants and binding sites of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at different temperatures

由表2可知，系列類(lèi)似物與BSA 均存在一定的結(jié)合作用，且結(jié)合位點(diǎn)約為1，即類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與BSA 相互作用形成1∶1的復(fù)合物。

2.4 結(jié)合模式的確定

小分子化合物與生物大分子之間的結(jié)合力包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力，結(jié)合作用模式主要由熱力學(xué)參數(shù)焓變（ΔH）和熵變（ΔS）反映。從熱力學(xué)角度看，ΔH＞0 和ΔS＞0 主要為疏水作用力，ΔH＜0和ΔS＜0反映范德華力或氫鍵的形成，而ΔH≈0和ΔS＞0 表明靜電相互作用［10－11］。熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS及自由能變?chǔ)可根據(jù)式（3）、（4）計(jì)算［12］：

式中：K為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)；R 為氣體常數(shù)。計(jì)算得到類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 作用體系的熱力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由表3可知，ΔG均為負(fù)值，可知系列類(lèi)似物與BSA 的結(jié)合反應(yīng)均為自發(fā)過(guò)程。類(lèi)似物Ⅳ－BSA 結(jié)合反應(yīng)的ΔH、ΔS均為負(fù)值，表明類(lèi)似物Ⅳ－BSA 結(jié)合作用力主要為氫鍵和范德華力，而類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH、ΔS均為正值，表明疏水作用力是類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA 結(jié)合反應(yīng)的主要作用力。

2.5 同步熒光光譜

同步熒光光譜反映了不同發(fā)色團(tuán)的性質(zhì)，當(dāng)發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)差設(shè)定為Δλ＝60nm 時(shí)，同步熒光光譜反映色氨酸殘基（Trp residues）的特征信息；當(dāng)Δλ＝15 nm 時(shí)，則反映酪氨酸殘基（Tyr residues）的特征信息［13－14］。系列類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 相互作用在25 ℃時(shí)的同步熒光光譜見(jiàn)圖4。

圖4 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由圖4可知，隨著類(lèi)似物的加入，同步熒光強(qiáng)度急劇下降，且均沒(méi)有發(fā)生藍(lán)移或者紅移，表明系列類(lèi)似物對(duì)BSA 色氨酸殘基及酪氨酸殘基微環(huán)境幾乎沒(méi)有影響。

類(lèi)似物－BSA 結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了能量的轉(zhuǎn)換，即有部分能量轉(zhuǎn)換為非輻射能（熒光猝滅），能量轉(zhuǎn)換的多少反映藥物與蛋白結(jié)合作用的強(qiáng)弱，能量轉(zhuǎn)換越大表明結(jié)合作用越強(qiáng)，結(jié)合反應(yīng)生成的復(fù)合物就越穩(wěn)定。在同步熒光檢測(cè)中，能量轉(zhuǎn)換效率（熒光猝滅效率）可用方程（5）計(jì)算［15］：

式中：F0和F為BSA 溶液的熒光強(qiáng)度和逐步加入類(lèi)似物時(shí)的同步熒光強(qiáng)度。以RSFQ對(duì)類(lèi)似物濃度［Q］作圖（圖5），可看出類(lèi)似物Ⅲ在△λ＝15nm 和△λ＝60nm 時(shí)的熒光能量轉(zhuǎn)換率都非常低，表明類(lèi)似物Ⅲ與BSA 的酪氨酸殘基及色氨酸殘基的結(jié)合作用不強(qiáng)，可以判斷類(lèi)似物Ⅲ可能存在著與BSA 上其它殘基的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)還可以看出類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ在△λ＝15nm 時(shí)的能量轉(zhuǎn)移比在△λ＝60nm 時(shí)的能量轉(zhuǎn)移低，可判斷類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ更易于與BSA 分子的的色氨酸殘基結(jié)合。4種藥物與BSA 在酪氨酸殘基和色氨酸殘基兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋孩簦劲瘢劲颍劲蟆?/p>

圖5 類(lèi)似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用體系的同步熒光猝滅率Fig.5 Ratios of synchronous fluorescence quenching of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

3 結(jié)論

在pH＝7.4、離子濃度為0.1 mol·L－1的條件下，對(duì)以水楊酸和磺胺為原料合成的4個(gè)新化合物水楊酸磺胺類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進(jìn)行光譜分析，研究其與BSA 的相互作用。4個(gè)新化合物對(duì)BSA 的熒光猝滅機(jī)理均為靜態(tài)猝滅，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，形成1∶1的復(fù)合物。類(lèi)似物Ⅳ與BSA 結(jié)合反應(yīng)的作用力主要為氫鍵和范德華力，而疏水作用力是類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA結(jié)合反應(yīng)的主要作用力。通過(guò)熱力學(xué)常數(shù)計(jì)算，可知系列類(lèi)似物與BSA 的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)過(guò)程。同步熒光光譜顯示，系列類(lèi)似物對(duì)BSA 色氨酸殘基及酪氨酸殘基微環(huán)境幾乎沒(méi)有影響。通過(guò)對(duì)同步熒光猝滅的能量轉(zhuǎn)換效率計(jì)算，可以判斷類(lèi)似物Ⅲ可能存在著與BSA 上其它殘基的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)類(lèi)似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ更易于與BSA 分子的色氨酸殘基結(jié)合。

（致謝：本研究受到廣西大型儀器協(xié)作公用網(wǎng)、廣西中醫(yī)藥研究院廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助。）

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