藍 慧，陳 帥，曹林友，鄧成剛，王 翀，田 云，盧向陽

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長沙410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南長沙410128）

在石油的勘探、開采、運輸、儲存及生產(chǎn)加工等過程中漏油事故頻繁發(fā)生，不僅污染土壤，導(dǎo)致土質(zhì)惡化，影響植物的生長發(fā)育［1］，而且導(dǎo)致水體中的溶氧量下降，影響水生生物的生長繁殖［2］。尤其是石油中的多環(huán)芳烴（PAHs）等有毒物質(zhì)具有強烈的致癌、致畸、致突變性，給人類健康帶來巨大危害［3－4］。因此，對石油污染的治理迫在眉睫。

原油是一種以烴類化合物為主的成分復(fù)雜的混合物，包括烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴和瀝青質(zhì)化合物［5－6］。當(dāng)前，治理石油污染常用的物理方法和化學(xué)方法均因費用昂貴及二次污染而受到限制，而微生物法因經(jīng)濟、有效、環(huán)保、無二次污染［7－9］，已被廣泛應(yīng)用于石油污染的治理。目前，已經(jīng)分離到大量的原油降解細菌，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）等［10－11］。研究表明，細菌降解原油的能力強于放線菌、真菌及酵母菌。Zhang等［12］分離篩選出一株銅綠假單胞菌DQ8，在柴油濃度為2%時，降解率高達83%，在原油濃度為10%時，降解率為35%～40%。Yu 等［13］分離出2 株石油降解菌Bacillus subtilisSWH－1 和SphingbacteriummultivorumSWH－2，降解率分別為33.9%和46.3%。El－Sheshtawy等［14］分離出2株原油降解菌PseudomonasxanthomarinaKMM 1447 和PseudomonasstutzerivATCC 17588，降解率為30%～50%。

表面活性劑是一類能使溶液體系界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質(zhì)，能降低表面張力，提高水溶性［15］。表面活性劑作為乳化劑在石油微生物降解過程中能提高微生物對石油的降解率［16－17］。

作者在此從被原油污染的土壤中篩選出一株嗜堿原油降解菌ODB04，對其進行鑒定及生長條件的優(yōu)化，并在最佳生長條件下對其降解能力進行研究，為該菌在微生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料與培養(yǎng)基

土壤樣品采集于被原油污染的土壤；原油購于中國石化。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂粉15～20g、蒸餾水1 000mL，pH 值7.0～7.2，121 ℃滅菌20min。

無機鹽培養(yǎng)基：參照文獻［17］。

1.2 原油降解菌的富集、分離與純化

在裝有100mL 無機鹽培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，加入5mL土壤樣品浸提液，添加1%原油作為唯一的碳源和能源，置于30 ℃、200r·min－1恒溫搖床培養(yǎng)一周；取10%的富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到已添加1%原油的新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，置于30 ℃、200r·min－1恒溫搖床培養(yǎng)一周，連續(xù)培養(yǎng)3次。取最后一次富集培養(yǎng)液，梯度稀釋至10－5，涂布于含0.1%原油的LB固體平板培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；挑取平板上的單菌落進行劃線分離純化，最后得到一株原油降解效果明顯的細菌，命名為ODB04。

1.3 原油降解菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

通過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實驗［18－20］，對細菌ODB04進行鑒定。

1.3.2 16 SrDNA 序列分析

提取細菌ODB04 總基因組DNA，擴增細菌ODB04的16SrDNA。引物設(shè)計為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR 反應(yīng)體系：5μL 的10×buffer，0.25μL 的Tap DNAase，4μL 的dNTP，引物各2 μL，2μL的模板，總反應(yīng)體系為50μL。PCR 條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸2 min，共32 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物回收后連接到pMD18－T vector上，經(jīng)陽性鑒定后送華大基因測序。

1.4 細菌ODB04最佳生長條件的確定

分別測試細菌ODB04在不同NaCl濃度（0、1%、2%、4%、6%、8%）、溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）和pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）條件下的生長情況，每組設(shè)3個平行，以確定其最佳生長條件。

1.5 最佳生長條件下的原油降解率

將細菌ODB04接種于LB 液體培養(yǎng)基中35 ℃、200r·min－1搖床振蕩培養(yǎng)，待菌株進入對數(shù)生長期時，5 000r·min－1離心10min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，再用無菌生理鹽水重懸浮，用分光光度計測定OD600＝1.0，備用。

在裝有35mL 含0.5 mL 原油無機鹽培養(yǎng)基的50mL帶蓋三角瓶中，加入2mLOD600＝1.0的菌懸液，在最佳生長溫度下，200r·min－1搖床振蕩培養(yǎng)7d，以不加菌懸液為對照，設(shè)3個平行。振蕩培養(yǎng)7d后，將培養(yǎng)液全部倒入分液漏斗中，加20mL 石油醚振蕩萃取培養(yǎng)液中殘留的原油，重復(fù)振蕩萃取2次，合并萃取液，60 ℃干燥至恒質(zhì)量，稱量，用重量法計算原油降解率。

1.6 最佳生長條件下表面活性劑對原油降解率的影響

在最佳生長條件下，分別測試0.05%（體積分數(shù)，下同）的非離子表面活性劑Tween 80和Triton X－100對細菌ODB04原油降解率的影響。以未加表面活性劑為對照，設(shè)3個平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 原油降解細菌的篩選與鑒定

以原油作為唯一的碳源和能源，通過富集培養(yǎng)，分離篩選到具有原油降解能力的細菌ODB04。對其進行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，結(jié)果見表1。

表1 原油降解細菌ODB04的生化特征Tab.1 Biochemical characteristics of crude oil－degrading strain ODB04

進一步提取細菌ODB04的總基因組DNA，用于16SrDNA 擴增，電泳圖譜見圖1。

將細菌ODB04的16SrDNA 序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，結(jié)果顯示與克雷伯氏菌屬有99%的同源性。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定結(jié)果，并參考伯杰氏細菌鑒定手冊，確定原油降解細菌ODB04屬肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）。

2.2 細菌ODB04最佳生長條件的確定

不同的NaCl濃度、溫度、pH 值等會影響原油的物理狀態(tài)、化學(xué)組成和微生物相關(guān)代謝酶的活性以及

圖1 細菌ODB04總DNA（a）和16SrDNA擴增回收產(chǎn)物（b）的電泳圖譜Fig.1 Electrophorograms of total DNA（a）and 16SrDNA amplified fragments（b）of strain ODB04

微生物生長過程中的滲透壓，從而影響對原油的降解率。NaCl濃度、溫度、pH 值對原油降解細菌ODB04生長的影響見表2。

表2 NaCl濃度、溫度和pH 值對原油降解細菌ODB04生長的影響Tab.2 Effect of NaCl concentration，temperature and pH value on growth of crude oil－degrading strain ODB04

由表2 可見：（1）隨著NaCl濃度的升高，細菌ODB04的生長受到抑制，在NaCl濃度高于6%后，細菌ODB04 不能生長。因此，確定最佳NaCl濃度為1%～2%。（2）在溫度低于25℃或高于45℃時，細菌ODB04的生長受到抑制。因此，確定最佳生長溫度為35 ℃。（3）細菌ODB04不能在酸性條件下生長，但是pH 值為11.0時，仍然能夠生長，說明該菌對堿性的忍耐性很強。確定最佳pH 值為8.0～9.0。

2.3 表面活性劑對細菌ODB04的原油降解率的影響

在最佳生長條件（NaCl濃度為1%～2%、溫度為35 ℃、pH 值為8.0～9.0）下，測定細菌ODB04的原油降解率，考察表面活性劑對原油降解率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 表面活性劑對細菌ODB04的原油降解率的影響Fig.2 Effect of surfactant on degradation rate of crude oil for strain ODB04

由圖2可知：（1）培養(yǎng)7d時，未添加表面活性劑的原油降解率為40%，添加0.05%非離子表面活性劑Tween 80的原油降解率為56%，添加0.05%非離子表面活性劑Triton X－100 對原油降解率影響不大。（2）在未添加表面活性劑的情況下，5d內(nèi)的原油降解率變化不大，可能是由于原油不溶于無機鹽培養(yǎng)基，特別是在第2d，可以在無機鹽培養(yǎng)基中明顯地看到很多小顆粒狀的油滴，阻礙了細菌ODB04對原油的降解利用。（3）在添加0.05%非離子表面活性劑Tween 80的情況下，3d 后的原油降解率迅速升高，原因可能是：Tween 80改變了細菌ODB04細胞膜的脂肪酸組成，增加了不飽和脂肪酸的含量，提高了細胞膜的流動性，有利于細菌ODB04 對原油的降解利用，另外Tween 80能減小表面張力，提高原油的水溶性，從而提高原油的生物利用度［21］。（4）0.05%的非離子表面活性劑Triton X－100 可能對細菌ODB04 有毒害作用，因而原油降解率變化不大。

3 結(jié)論

以原油作為唯一的碳源和能源，從被原油污染的土壤中分離得到一株嗜堿原油降解細菌ODB04，通過對該細菌的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗及16SrDNA序列分析，鑒定該菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。細菌ODB04的最佳生長條件為NaCl濃度1%～2%、溫度35 ℃、pH 值8.0～9.0。在該條件下培養(yǎng)7d，細菌ODB04對原油的降解率為40%，在添加0.05%非離子表面活性劑Tween 80 的情況下，原油降解率高達56%，0.05%非離子表面活性劑Triton X－100 對原油降解率影響不大。表明，細菌ODB04有很高的原油降解率，具有很強的耐堿能力，對豐富微生物資源和生物修復(fù)原油污染土壤具有一定的意義。

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