孫 茜，呂志堂，孫雅堃

（1.河北省保定市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北保定071002;2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，河北保定071002）

應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速篩查重癥監(jiān)護(hù)室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌定植者

孫 茜1，呂志堂2*，孫雅堃1

（1.河北省保定市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北保定071002;2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，河北保定071002）

目的 建立耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，篩查重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）MRSA定植者。方法 采集患者感染部位標(biāo)本或鼻咽拭子標(biāo)本，快速提取總DNA后應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)標(biāo)本中nuc和mecA基因，對(duì)于雙陽(yáng)性結(jié)果報(bào)MRSA陽(yáng)性，采取早期干預(yù)措施。結(jié)果 建立的熒光定量PCR方法靈敏度高（4 CFU/反應(yīng)）、快速、準(zhǔn)確率100%。采取篩查和干預(yù)降低了ICU的MRSA感染率。結(jié)論 應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)MRSA早期篩查及干預(yù)，有助于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療，可有效防止或終止MRSA導(dǎo)致的醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;聚合酶鏈反應(yīng);篩查

自上世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）以來(lái)［1］，MRSA經(jīng)歷了快速進(jìn)化和流行擴(kuò)張，在全球范圍內(nèi)已從醫(yī)院向社區(qū)擴(kuò)散并迅速發(fā)展為社區(qū)感染最重要的病原菌［2］。根據(jù)衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2006—2007年對(duì)84家醫(yī)院的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)醫(yī)院MRSA的感染率占院內(nèi)感染的56%左右，個(gè)別醫(yī)院甚至高達(dá)70%，而重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）中MRSA的感染率較普通病房高出20%～30%，ICU已成為MRSA感染防控的重點(diǎn)［3］。探討MRSA感染高危人群、高危因素的防控措施，降低MRSA感染率，終止MRSA院內(nèi)傳播，避免醫(yī)院感染暴發(fā)流行事件發(fā)生，確保醫(yī)療安全已成為大多數(shù)研究者的共識(shí)［4－6］。本研究旨在建立快速、高靈敏度的MRSA定量PCR檢測(cè)方法，以期為ICU的MRSA防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株及標(biāo)本 2009—2011年河北省保定市第一中心醫(yī)院分離并經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定的實(shí)驗(yàn)用MRSA菌株135株、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillinsensitive S.aureus，MSSA）菌株83株，根據(jù)CLSI2011年標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分。2012年1—12月共篩查臨床標(biāo)本231份，均取自入住ICU前患者感染部位或鼻咽拭子。所有實(shí)驗(yàn)均以金黃色葡萄球菌ATCC 33591作為 MRSA對(duì)照菌株，以金黃色葡萄球菌ATCC29213作為MSSA對(duì)照菌株。

1.2 DNA提取 首先將標(biāo)本置于1.5 mL離心管中，加入400μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris.Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0），渦旋振蕩1 min（純培養(yǎng)不用該步驟），將懸液12 000r/min離心5 min，棄上清，應(yīng)用百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（溶液型）提取，其中酶解步驟加入20 U的溶葡球菌酶（上海生工），最后溶解DNA改用20μL DNA溶解液，其余步驟按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 熒光定量PCR引物、探針及擴(kuò)增方法 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的金黃色葡萄球菌nucA基因擴(kuò)增引物Fnuc：5＇－GCGATTGATGGTGATACGGT－3＇，Rnuc：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC－3＇［7］。進(jìn)一步優(yōu)化引物序列和特征參數(shù)后使用的nucA基因擴(kuò)增引物 Fnuc＇：5＇－GCGATTGATGGT－GATACKGT－3＇，Rnuc＇： 5＇－AGCCAAGCCTTGA－CGAACT。 采 用UltraSYBR Mixture（CWBIO）50μL體系，DNA模板用量5μL，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃ 10 min，變性94℃10 s，復(fù)性59.2℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線59.2～94℃。

mecA基因擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行，擴(kuò)增引物 mecA－F：5＇－CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT－3＇ 和 mecA－R： 5＇－TTTACGACTTGTTGCATACCATC－3＇;探針為 mecA－HP－1：5＇－CAGGTTACGGACAAGGTGAAATACTG ATT－［fam］3＇和 mecA－HP－2： 5＇ ［Red 640］－ACCCAGTACAGATCCTTTCAATCTATAGCG－p3＇。 采 用GoldStar TaqMan Mixture（CWBIO）50μL體系，DNA模板用量5μL，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 10 min，變性95℃ 10 s，復(fù)性50℃ 10 s，延伸72℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)，溶解曲線45～75℃［8］。以上擴(kuò)增均在Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀上完成。

1.4 干預(yù)措施 對(duì)于確診MRSA感染者及攜帶者，及時(shí)采取隔離措施，加強(qiáng)對(duì)其他監(jiān)護(hù)患者，特別是抵抗力低下患者的保護(hù)性措施。醫(yī)務(wù)人員相對(duì)固定，專人診療護(hù)理。此外，采取加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生干預(yù)、嚴(yán)格無(wú)菌操作等措施［5］。

2 結(jié) 果

2.1 nuc擴(kuò)增引物優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)與GenBank中已注冊(cè)的核酸序列Blast比對(duì)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化得到nuc基因定量 PCR擴(kuò)增特異引物 Fnuc＇：5＇－GCGATTGATGGTGATACKGT－3＇ 和 Rnuc＇： 5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAA－3＇。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將已知濃度為3.9×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋梯度分別為10－1～10－5，然后用改進(jìn)的nuc基因特異引物和文獻(xiàn)報(bào)道的mecA引物進(jìn)行熒光定量PCR［9］。擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)反應(yīng)體系中DNA對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌菌落形成單位（colony forming test，CFU）和反應(yīng)的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到nuc基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為： y=－3.563x+38.39（R2=1.000）（其中y表示Ct值，x表示lg CFU）;得到mecA基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=－3.623x+40.11（R2=0.997）（其中y表示Ct值，x表示lg CFU），線性良好。實(shí)驗(yàn)條件下MRSA菌株純培養(yǎng)的檢測(cè)下限為4 CFU/反應(yīng)體系。

2.3 臨床分離菌株驗(yàn)證結(jié)果 分別對(duì)本醫(yī)院2009—2011年分離得到的83株MSSA菌株和135株MRSA菌株進(jìn)行nuc基因和mecA基因熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果所有菌株均為 nuc陽(yáng)性，且所有MSSA菌株均為mecA陰性，所有MRSA菌株均為mecA陽(yáng)性，結(jié)果100%相符，說(shuō)明本研究改進(jìn)的方法是成功的。

2.4 臨床標(biāo)本篩選結(jié)果 2012年1—12月，采用定量PCR法篩查了231份取自入住ICU前患者感染部位或鼻腔拭子的臨床標(biāo)本，并對(duì)相應(yīng)標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)分離鑒定和藥敏測(cè)定。定量PCR檢測(cè)中對(duì)于雙陽(yáng)性結(jié)果者報(bào)MRSA陽(yáng)性，從感染部位取標(biāo)本，3種檢測(cè)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從鼻咽拭子取標(biāo)本，定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性率高于其他2種方法（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 定量PCR和常規(guī)分離培養(yǎng)法篩選MRSA感染結(jié)果比較Table 1 Comparison in MRSA infection screening between quantitative PCR and conventional isolated cu lture （株數(shù)，%）

2.5 ICU的MRSA防控效果分析 自2012年6月起，我院ICU根據(jù)MRSA定量PCR篩查結(jié)果，采取了相應(yīng)防控措施，通過(guò)持續(xù)1年的統(tǒng)計(jì)，我院ICU的MRSA院內(nèi)感染發(fā)生率由之前的9.6例/1 000例患者降低至4.2例/1 000例患者，效果明顯;同時(shí)有助于提高ICU的床位利用率。

3 討 論

盡管醫(yī)院感染管理和消毒隔離制度不斷完善且常規(guī)監(jiān)控措施已實(shí)施，而MRSA感染發(fā)病率并未下降，已成為各醫(yī)院面臨的一大難題。雖然少數(shù)研究者認(rèn)為對(duì)ICU患者主動(dòng)篩查對(duì)降低MRSA感染沒(méi)有意義［9］，但由于MRSA定植者可以將MRSA傳染給他人，且MRSA定植者較非定植者更容易發(fā)生MRSA感染，多數(shù)研究者認(rèn)為篩查MRSA定植者并進(jìn)行干預(yù)，對(duì)于降低MRSA感染的發(fā)病率，終止MRSA在院內(nèi)的傳播，避免醫(yī)院感染暴發(fā)流行事件發(fā)生具有重要意義［4－6］。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)MRSA的方法都是基于培養(yǎng)的方法，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)48～72 h［10］，對(duì)MRSA防控指導(dǎo)意義不大，應(yīng)用PCR技術(shù)快速檢測(cè)篩查MRSA攜帶者已成為發(fā)展趨勢(shì)［11－13］。目前，使用快速煮沸裂解法和商業(yè)化的DNA提取試劑盒［13－14］即使經(jīng)過(guò)樣品富集，其熒光定量PCR檢測(cè)下限也在10 CFU/拭子左右，而且對(duì)于富集分離陽(yáng)性的標(biāo)本有可能漏檢［15］，應(yīng)用普通PCR方法檢測(cè)靈敏度則在103 CFU左右［7］。

本研究經(jīng)與GenBank中已注冊(cè)的核酸序列Blast比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)：文獻(xiàn)中報(bào)到的nuc正向引物Fnuc：5＇－GCGATTGATGGTGATACGGT－3＇［7］的覆蓋度不高，與之匹配的大部分金黃色葡萄球菌nuc基因在引物序列的第18位堿基不是G而是T。也就是說(shuō)，現(xiàn)有引物在檢測(cè)中可能遺漏部分已知金黃色葡萄球菌菌株。因此，我們?cè)诘?8位設(shè)計(jì)兼并堿基K（G或T），以提高引物的覆蓋度，減少漏檢。此外，反向引 物 Rnuc：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC－3＇［8］和部分菌株3＇末端不匹配，經(jīng)過(guò)改進(jìn)得到Rnuc＇：5＇－AGCCAAGCCTTGACGAA－CTAA－3＇，不僅與目的菌株的匹配程度提高，而且Tm值為63.74℃，與正向引物更接近，改善了擴(kuò)增效果。

改進(jìn)的方法較文獻(xiàn)報(bào)道的方法檢測(cè)靈敏度有較大提高［13－14，16］，可能是在細(xì)胞裂解時(shí)使用溶葡球菌酶，提高了DNA提取效率的結(jié)果?？傮w上，定量PCR法對(duì)MRSA的檢出率與富集分離法相當(dāng)，對(duì)于鼻咽拭子中MRSA的檢出率要顯著高于直接分離法;即使與富集分離法相比，定量PCR法對(duì)鼻腔拭子的檢出率也略高于富集分離法（P＜0.05）。定量PCR法不僅靈敏，而且整個(gè)過(guò)程只需5～7 h，較常規(guī)方法的48～72 h的效率大大提高。

針對(duì)金黃色葡萄球菌難破壁的特性，在DNA提取時(shí)加入溶葡萄球菌酶有助于提高DNA提取效率，本研究改進(jìn)的nuc引物降低引物覆蓋度不高而導(dǎo)致的漏檢，從而提高了檢測(cè)靈敏度;根據(jù)nuc基因和mecA基因定量PCR篩查MRSA感染者和攜帶者，可實(shí)現(xiàn)MRSA患者（攜帶者）早發(fā)現(xiàn)、早診斷，結(jié)合采用及時(shí)隔離、強(qiáng)化衛(wèi)生干預(yù)等措施，對(duì)于降低MRSA院內(nèi)感染具有重要意義。

［1］ No authors listed."Celbemom"－resistant Staphylococci［J］.Br Med J，1961，1（5219）：113－114.

［2］ Lowy FD.Staphylococcus aureus infections［J］.N Engl JMed，1998，339（8）：520－532.

［3］ 林金蘭，李六億.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染及社區(qū)感染的流行特點(diǎn)［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21 （12）：2604－2606.

［4］ Jain R，Kralovic SM，Evans ME，et al.Veterans Affairs initiative to prevent methicillin－resistant Staphylococcus aureus infections［J］.N Engl JMed，2011，364（15）：1419－1430.

［5］ 陳華，付秀蓮，林筱穎，等.重癥監(jiān)護(hù)室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染早期篩查與護(hù)理干預(yù)［J］.中華感染控制雜志，2011，10（4）：292－293.

［6］ 陳旭，肖淑珍，董丹，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用評(píng)估［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（12）：1035－1039.

［7］ Hein I，Lehner A，Rieck P，et al.Comparison of different approaches to quantify Staphylococcus aureus cells by real－time quantitative PCR and application of this technique for examination of cheese［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67 （7）：3122－3126.

［8］ Shrestha NK，Tuohy MJ，Hall GS，et al.Rapid identification of Staphylococcus aureus and the mecA gene from BacT/ALERT blood culture bottles by using the LightCycler System［J］.JClin Microbiol，2002，40（7）：2659－2661.

［9］ HuskinsWC，Huckabee CM，O＇Grady NP，et al.Intervention toreduce transmission of resistant bacteria in intensive care［J］.N Engl JMed，2011，364（15）：1407－1418.

［10］ 吳文娟，湯一葦.醫(yī)院感染控制中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌篩查現(xiàn)狀［J］.傳染病信息，2009，22（1）：54－57.

［11］ W ren MW，Carder C，Coen PG et al.Rapidmolecular detection of methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］.JClin Microbiol，2006，44（4）：1604－1605.

［12］ Malhotra－Kumar S，van Heirstraeten L，Lee A，et al.Evaluation of molecular assays for rapid detection of methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］.JClin Microbiol，2010，48（12）：4598－4601.

［13］ Hagen RM，Seegmüller I，Navai J，et al.Development of a realtime PCR assay for rapid identification of methicillin－resistant Staphylococcus aureus from clinical samples［J］.Int J Med Microbiol，2005，295（2）：77－86.

［14］ Reischl U，Linde HJ，Metz M，et al.Rapid identiflcation of methicillin－resistant Staphylococcus aureus and simultaneous species confirmation using real－time fluorescence PCR［J］.JClin Microbiol，2000，38（6）：2429－2433.

［15］ Warren DK，Liao RS，Merz LR，et al.Detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus directly from nasal swab specimens by a real－time PCR assay［J］.JClin Microbiol，2004，42（12）：5578－5581.

［16］ 王艷，葉冬青，李家斌，等.二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［J］.中國(guó)抗生素雜志，2007，32（4）：225－228，255.

（本文編輯：許卓文）

Rapid screening ofm ethicillin resistant Staphylococcus aureus colonised patients in ICU using fluorescent quantitative polymerase chain reaction

SUN Qian1，LV Zhi－tang2*，SUN Ya－kun3
1． Clinical Laboratory，No． 1 Central Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071000，China; 2． College of Life Sciences，Hebei University ＆ Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，Hebei Province，Baoding 071002，China）

Objective To establish the fluorescent quantitative polymerase chain reaction（QPCR）method for screening methicillin resistant Staphylococcus aureus（MRSA）colonised patients of intensive care unit（ICU）.MethodsCollecting the infection specimen or nasal swabs，extracting the DNA，and detecting the nuc gene and mecA gene within the sample by Q－PCR.For the double positive results specimen，MRSA positive was reported and intervening measures were adopted.ResultsThe QPCR method improved in this study was rather quick and showed high sensitivity（4 CFU/reaction）and accuracy（100%）.Q－PCR screen and early infection controlmeasures reduced the MRSA infection rate of ICU.ConclusionEarly screening and intervening of MRSA are helpful to early detection，diagnosis，quarantine and treatment，and also can effectively prevent or stop hospital infection outbreak caused by MRSA.

methicillin－resistant staphylococcus aureus;polymerase chain reaction;screening

R735.7

A

1007－3205（2015）03－0309－04

2014－04－23;

2014－04－25

孫茜（1972－），女，河北保定人，河北省保定市第一中心醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。

*通訊作者。E－mail：lzt325@126.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.018