呂海宏，湯旭磊，傅松波

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

·論著·

葛根素影響雌激素受體α啟動(dòng)子甲基化調(diào)控成骨細(xì)胞增殖分化的研究

呂海宏，湯旭磊，傅松波

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

[摘要]目的探究葛根素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞代謝調(diào)控的途徑，為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療提供理論依據(jù)。方法取新生SD大鼠的顱骨，膠原酶法培養(yǎng)成骨細(xì)胞，分別加入不同濃度(5、10、25、50、100 μmol/L)葛根素分組培養(yǎng)，應(yīng)用巢式甲基敏感性聚合酶鏈反應(yīng)方法觀察雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)啟動(dòng)子A區(qū)甲基化，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法觀察ERα mRNA表達(dá)，MTT法和對(duì)硝基苯磷酸酯方法觀察體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖及堿性磷酸酶活性。結(jié)果隨著葛根素濃度增加，ERα 基因啟動(dòng)子甲基化程度逐漸減弱；同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中ERα mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，25 μmol/L葛根素濃度時(shí)表達(dá)最強(qiáng)(P<0.01)。葛根素能刺激成骨細(xì)胞增殖，提高堿性磷酸酶活性(P<0.01)。結(jié)論葛根素抑制ERα啟動(dòng)子甲基化及增加ERα mRNA表達(dá)，可能通過(guò)此途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化。

[關(guān)鍵詞]成骨細(xì)胞；葛根素；DNA甲基化；雌激素受體α

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.005

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是臨床常見的流行病，具有很高的患病率和骨折導(dǎo)致的致殘率。研究認(rèn)為骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制主要是由于骨重建失衡導(dǎo)致此病發(fā)生，絕經(jīng)后婦女骨吸收能力明顯大于骨形成，造成骨重建失衡，因此主導(dǎo)骨重建的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)控受到更多重視。體內(nèi)外骨質(zhì)疏松模型相關(guān)研究表明雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)與成骨細(xì)胞的增殖分化有關(guān)[1]。葛根素是結(jié)構(gòu)及生物活性均類似于雌激素的非甾體類化合物，為雜環(huán)多酚類化合物，可以與雌激素受體結(jié)合，具有弱雌激素活性，但葛根素對(duì)成骨細(xì)胞代謝調(diào)控的具體機(jī)制目前并不十分清楚。本研究旨在探討葛根素與ERα甲基化的關(guān)系以及對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的調(diào)控，報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)及處理取新生(<24 h)SD大鼠，清洗，乙醇浸泡10 min，取顱蓋骨，PBS沖洗3遍，剪碎頭蓋骨。移入10 mL0.25%胰蛋白酶溶液，5 mLⅡ型膠原酶溶液，依次振蕩消化，棄上清液。沉淀細(xì)胞團(tuán)塊用DMEM/F12液沖洗并懸浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞懸液混勻以1×106/mL密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、換液，傳代培養(yǎng)備用。實(shí)驗(yàn)前PBS沖洗，接種細(xì)胞于培養(yǎng)板上，然后加入無(wú)血清的DMEM/F12，分別加入0、5、10、25、50、100 μmol/L不同濃度葛根素分組培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑CO2恒溫培養(yǎng)箱和低溫離心機(jī)(德國(guó)Heraeus)；SPECORD 40紫外分光光度儀(英國(guó)analyticjena公司)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；PCR儀(Eppendorf公司生產(chǎn))；紫外凝膠成像儀(美國(guó)Thermo Forma公司生產(chǎn))。Puerarin、Biozol及TRIZOL試劑(Sigma-Aldrich)；ZR Genomic DNA 成套試劑盒、DNA 片段恢復(fù)成套試劑盒及RT-PCR試劑盒(Tiangen Biotech Company)；PNPP、亞硫酸氫鈉、Triton X-100、Tris-HCl、1%茜素紅及2%堿性磷酸酶等試劑(Sino-American Biotechnology Company)。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)細(xì)胞染色鑒定①茜素紅染色法： PBS沖洗成骨細(xì)胞2遍，然后用95%酒精固定10 min，1%茜素紅(pH 4.2)染色，PBS沖洗觀察。②堿性磷酸酶染色法： PBS沖洗成骨細(xì)胞2遍，95%酒精固定10 min，2%堿性磷酸酶(pH 8.2)染色，PBS沖洗觀察。

1.3.2DNA提取培養(yǎng)傳代細(xì)胞中加入不同濃度葛根素進(jìn)行培養(yǎng)，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書常規(guī)操作進(jìn)行成骨細(xì)胞基因組DNA的提取。

1.3.3亞硫酸鹽修飾和DNA恢復(fù)①將DNA濃度稀釋為20 μg/μL，取10 μL DNA加入50 mL雙脫水，5.5 mL3 mmol/L氫氧化鈉，混勻后孵育42 ℃30 min，使DNA充分溶解變性。②每個(gè)試管分別依次加入對(duì)苯二酚、3 mmol/L亞硫酸氫鈉(NaHSO3)(pH 5.0)，混勻，低溫離心，按照說(shuō)明書指示將經(jīng)過(guò)上述處理的DNA脫鹽，異丙醇沖洗樣品，加入50 mL37 ℃熱水恒溫箱進(jìn)行溫育，低速離心1 min。③再將10 mol/L NaAc(pH 5.2)和無(wú)水乙醇加入試管混勻，離心，棄溶液，留白色沉淀。DNA沉淀用-20 ℃預(yù)冷的70%酒精反復(fù)沖洗后過(guò)夜，真空干燥，用20 mL水溶解沉淀。洗脫的DNA樣品立即儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4體外培養(yǎng)細(xì)胞ERα啟動(dòng)子甲基化測(cè)定①巢式甲基化特異性PCR(nested methylation-specific polymerase chain reaction，nMS-PCR)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)Genebank中查詢到的登錄號(hào)為AY425004的ERα基因DNA序列，設(shè)計(jì)nMS-PCR的內(nèi)外引物。nMS-PCR法包括兩步PCR反應(yīng)，第一步PCR使用的是不含任何CG序列的外側(cè)引物，第二步PCR使用的內(nèi)側(cè)引物，其中ERα的內(nèi)側(cè)引物位于ERα基因序列的啟動(dòng)子區(qū)，共包含有8個(gè)CG序列，引物由上海生物工程公司合成,見表1。②nMS-PCR方法：應(yīng)用Touchdown(TD) PCR方法擴(kuò)增，按照試劑盒第一輪25 μL PCR反應(yīng)體系加入試劑，ER-pN 20 μmol/L 0.3 μL,DNA 2 μL,2×Taq PCR Mastermix 6.3 μL,15 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0),25 mmol/L KCl,2.5 mmol/L MgCl2,250 μmol/L 4種dNTP，1 μL上、下游引物，3 μL DNA模板，加入25 μL蒸餾水。第二輪PCR反應(yīng)DNA模板應(yīng)用第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。隨著熱啟動(dòng)，樣品應(yīng)用Touchdown(TD) PCR方法進(jìn)行20輪的擴(kuò)增。

表1　ERα 的nMS-PCR引物Table 1　nMS-PCR primer of ER-α

1.3.5RT-PCR法檢測(cè)ERα mRNA表達(dá)(1)RNA提?。号囵B(yǎng)傳代細(xì)胞加入不同濃度葛根素進(jìn)行培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS沖洗2遍，加入1 mL TRIZOL，采用氯仿提取、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌、DEPC溶解RNA。詳細(xì)過(guò)程按照TRIZOL說(shuō)明進(jìn)行，紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度，以保證cDNA合成時(shí)模板量一致。按Invitrogen公司RNA分離試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取RNA備用。(2)cDNA制備：總RNA經(jīng)鑒定純度和濃度符合要求后，用于制備cDNA。①加入1~2 μg總RNA和1 μL50 pmol/L Oligo(dT)18 primer至經(jīng)過(guò)焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)處理后的EP管中，再加入DEPC水，使體積總量至12 μL。②依次加入下列試劑混合離心，4 μL5×RT Buffer，1 μL RNase Inhibitor(10 U/mL)，2 μL dNTP Mixture(10 mmol/L)，1 μL ReverTra Ace。所得產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增或置于-20 ℃保存。(3)PCR擴(kuò)增目標(biāo)cDNA：① 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank中查詢到的登錄號(hào)NM000125的ERα基因mRNA序列，使用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列如下，GADPH管家基因用做內(nèi)參照，引物由上海生物工程技術(shù)公司合成。ERα引物序列為5′-CCCTTG-CTATGTTACTAAGCGTGAGTGCC ATAGGA-ATACAAGAGGGTGCT-3′;ERα forward:5′-AG-CACCCTGAAGTCTCTGGA-3′;ERα reverse:5′-GATGTGGGAGAGGATGAGGA-3′。②PCR反應(yīng)體系組分25 μL PCR反應(yīng)體系包括Taq Polymerase,4種dNTP，Tris-HCl(pH8.3)，50 mmol/L KC1，1.5 mmol/L MgCl2，1 μL上下游引物，3 μL cDNA模板。③ PCR反應(yīng) 預(yù)變性94 ℃3 min后；變性94 ℃，退火61 ℃，延伸72 ℃各進(jìn)行45 s 30個(gè)循環(huán)；最后終延伸72 ℃5 min結(jié)束。④反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 取出5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，混合1 μL 6×瓊脂糖凝膠電泳加樣緩沖液，上樣于0.5 ×TBE緩沖液配制的l%瓊脂糖凝膠中，在0.5×TBE緩沖液中90V電泳45 min，紫外分析儀下觀察結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)中分析PCR結(jié)果。

1.3.6MTT法培養(yǎng)成骨細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化后傳代，相同細(xì)胞密度(2×103/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞匯合90%，加入無(wú)血清DMEM/F12，依次加入5、10、25、50、100 μmol/L葛根素作用72 h。PBS沖洗，每孔加入10 μL0.5%MTT，孵育3 h，加100 μL 10%SDS，酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)570 nm處，測(cè)定吸光度值(A)。細(xì)胞量與MTT吸光度值正相關(guān)。成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)率=(A干預(yù)組-A對(duì)照組)/A對(duì)照組×100%。

1.3.7堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測(cè)定用0.25%胰蛋白酶溶液消化半?yún)R合成骨細(xì)胞，相同細(xì)胞密度(2×103/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞匯合90%，加入無(wú)血清DMEM/F12溶液，然后分別依次加入5、10、25、50、100 μmol/L葛根素作用72 h后p-NPP法測(cè)定。取培養(yǎng)液10 μL于96孔板，加p-NPP-DEA溶液90 μL，37 ℃水浴20 min，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)405 nm處，測(cè)定吸光度值(A)。通過(guò)樣品A值在ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活性值(U/L)。成骨細(xì)胞分化促進(jìn)率=(Z干預(yù)組ALP-Z對(duì)照組ALP)/Z對(duì)照組ALP×100%。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定

2.1.1活體細(xì)胞觀察倒置相差顯微鏡下，剛接種細(xì)胞呈球形，24 h后存活細(xì)胞基本貼壁，展開后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈三角形、多角形，有較多突起，單核呈卵圓形，含1~3個(gè)核仁，胞漿豐富。傳代培養(yǎng)，生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相多見，突起互相連接，細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，呈鋪路石狀。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)梭形、多角形等多種形態(tài)(圖1)。

2.1.2ALP染色ALP為成骨細(xì)胞系合成分泌的標(biāo)志性功能酶。分化成熟、功能活躍的成骨細(xì)胞質(zhì)中ALP組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。應(yīng)用偶氮偶聯(lián)法染色，酶活性部位與偶氮染料形成不溶性藍(lán)色沉淀(圖2)。

2.1.3礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色成骨細(xì)胞具有體外礦化的功能特征，細(xì)胞傳代培養(yǎng)，出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，其間可見白色不透光圓形的礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色法礦化結(jié)節(jié)染色呈紅色，顯示成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)(圖3)。

圖1　匯合狀OB(×100)Figure 1　Confluence of OB(×100)

圖2　OB ALP染色(×100)Figure 2　ALP dyeing of OB(×100)

圖3　OB礦化結(jié)節(jié)染色(×40)Figure 3　Mineral nodules dyeing of OB(×40)

2.2葛根素對(duì)細(xì)胞ERα啟動(dòng)子A區(qū)甲基化的影響不同濃度葛根素處理傳代成骨細(xì)胞8 d后，ERα啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的結(jié)果顯示，隨著劑量增加，基因啟動(dòng)子A 區(qū)甲基化程度逐漸減弱，25 μmol/L葛根素濃度時(shí)表達(dá)最弱，此后增加濃度無(wú)明顯減弱。隨著葛根素濃度逐漸增加(5、10、25、50、100 μmol/L)，甲基化條帶變得越來(lái)越弱，25 μmol/L葛根素濃度時(shí)表達(dá)最弱；未甲基化條帶變得越來(lái)越強(qiáng)，成骨細(xì)胞25 μmol/L葛根素濃度培養(yǎng)時(shí)表達(dá)最強(qiáng)(圖4)。

圖4　葛根素干預(yù)成骨細(xì)胞后ERα啟動(dòng)子A區(qū)甲基化狀態(tài)U:引物ER-pU的DNA序列中，經(jīng)NaHSO3處理后未甲基化胞嘧啶被修飾為胸腺嘧啶的未甲基化PCR 條帶；M: 甲基化胞嘧啶經(jīng)NaHSO3處理后未被修飾，DNA序列仍是胞嘧啶的甲基化PCR條帶

Figure 4The methylation status of ERa in cells treated by different concentrations of puerarin

2.3甲基化水平對(duì)細(xì)胞ERα mRNA表達(dá)的影響為明確ERα基因啟動(dòng)子甲基化程度與ERα mRNA表達(dá)水平是否有相關(guān)性。應(yīng)用半定量 RT-PCR 方法檢測(cè)成骨細(xì)胞中ERα mRNA的表達(dá)，細(xì)胞用不同濃度梯度葛根素處理12 d后進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)隨著葛根素濃度增加，ERα 基因啟動(dòng)子甲基化程度逐漸減弱；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，細(xì)胞中ERα mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，25 μmol/L葛根素濃度時(shí)表達(dá)最強(qiáng)。見圖5、表2。

圖5　葛根素處理后成骨細(xì)胞ERα mRNA表達(dá)Figure 5　The expressions of ERα mRNA in cells treated by different concentrations of puerarin

2.4葛根素對(duì)細(xì)胞增殖的影響MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)率，隨著葛根素濃度增加，成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖呈現(xiàn)顯著增加，25 μmol/L濃度培養(yǎng)最強(qiáng)，此后隨濃度增加，未再進(jìn)一步增加，并呈現(xiàn)下降趨勢(shì),見表2。

2.5葛根素對(duì)細(xì)胞分化的影響p-NPP法測(cè)定細(xì)胞中堿性磷酸酶活性的絕對(duì)值與細(xì)胞量的比值來(lái)分析細(xì)胞分化能力，了解葛根素對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用。成骨細(xì)胞分別加入0、5、10、25、50、100 μmol/L葛根素培養(yǎng)72 h，成骨細(xì)胞ALP活性隨著葛根素濃度增加，成骨細(xì)胞分化促進(jìn)率明顯增加，25 μmol/L葛根素濃度培養(yǎng)時(shí)最強(qiáng)，此后增加濃度時(shí)，細(xì)胞分化促進(jìn)率未再進(jìn)一步增加,見表2。

表2　葛根素處理后成骨細(xì)胞ALP活性、增殖促進(jìn)率和ERα/GAPDH比值Table 2　ALP activity,cells proliferation and ERα/GAPDH on osteoblasts treated by puerarin

*P<0.05與對(duì)照組比較#P<0.01對(duì)照組比較(Dunntt檢驗(yàn))

3討論

雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要原因，雌激素替代療法能有效地預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。但應(yīng)用雌激素替代治療也引發(fā)了某些安全問(wèn)題，長(zhǎng)期單獨(dú)使用雌激素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌及血栓栓塞性疾病發(fā)生率升高[2]。葛根素是從中藥葛根中提取的單體化合物，是葛根的主要有效成分之一，其化學(xué)名為4,7-二羥基8-D吡喃葡萄糖醛基異黃酮，相對(duì)分子質(zhì)量為 416，屬于植物雌激素，具有雌激素樣活性，而不良反應(yīng)卻較少[3]。

研究發(fā)現(xiàn)ERα存在于多種細(xì)胞中，包括成骨細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，如果雌激素結(jié)合ERα，通過(guò)核內(nèi)ER經(jīng)典基因組效應(yīng)，雌激素與ER結(jié)合后受體發(fā)生空間構(gòu)象改變而形成二聚體，從而暴露DNA結(jié)合區(qū)使特異DNA序列與之結(jié)合，即靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的雌激素效應(yīng)元件(estrogen response element,ERE)與之結(jié)合，并募集輔助因子形成轉(zhuǎn)錄啟始復(fù)合物而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，將會(huì)激發(fā)一系列效應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和多種細(xì)胞活動(dòng)，促使細(xì)胞的增殖和分化[4-7]。隨著甲基化檢測(cè)手段的進(jìn)展，DNA甲基化逐漸成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，DNA甲基化抑制基因表達(dá)，而去甲基化增強(qiáng)基因表達(dá)。研究表明雌激素增強(qiáng)ERα基因表達(dá)，并與DNA甲基化有關(guān)。Penolazzi等[8]研究原代成骨細(xì)胞和骨髓來(lái)源MG-63 、SaOS-2細(xì)胞系ERα基因表達(dá)與ERα中F區(qū)啟動(dòng)子內(nèi)CpG島的甲基化，定量RT-PCR分析認(rèn)為ERα中F區(qū)啟動(dòng)子內(nèi)CpG島的甲基化控制ERα基因轉(zhuǎn)錄，直接或間接影響其在特定組織基因表達(dá)。Dansranjavin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)BMSC成骨表型基因呈高甲基化狀態(tài)，而RT-PCR法檢測(cè)OC、OPN、OSX、Runx2 mRNA表達(dá)呈陰性。

葛根素等植物雌激素防治骨質(zhì)疏松的報(bào)道越來(lái)越引起人們重視，葛根素不僅抑制骨吸收，而且促使骨形成。一方面是通過(guò)影響堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化；另一方面是通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的骨形成效應(yīng)[10]。葛根素與雌激素結(jié)構(gòu)類似，研究葛根素對(duì)成骨細(xì)胞ERα啟動(dòng)子內(nèi)CpG島甲基化的影響，及其與成骨細(xì)胞ERα表達(dá)的關(guān)系，有助于我們更清楚葛根素調(diào)控成骨細(xì)胞代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究結(jié)果顯示隨著葛根素濃度梯度增加，成骨細(xì)胞 ERα啟動(dòng)子A 區(qū)甲基化程度逐漸減弱，25 μmol/L葛根素濃度時(shí)表達(dá)最弱，此后未進(jìn)一步減弱；同時(shí)成骨細(xì)胞ERα mRNA表達(dá)增加，有明顯的劑量依賴性，25 μmol/L葛根素濃度組達(dá)到峰值，此后隨著濃度增加，細(xì)胞ERα表達(dá)未見明顯增加。本研究結(jié)果也顯示葛根素增加成骨細(xì)胞增殖分化，25 μmol/L葛根素組濃度最高，此后隨著濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；葛根素濃度太低(<5 μmol/L)時(shí)，細(xì)胞增殖分化不明顯；達(dá)到適合濃度后(25 μmol/L)顯著增強(qiáng)；但是濃度太高(>25 μmol/L)時(shí)，成骨細(xì)胞增殖分化有減弱趨勢(shì)，這可能為葛根素毒性作用損傷細(xì)胞所致，仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，葛根素達(dá)到適合濃度后可能通過(guò)抑制成骨細(xì)胞 ERα啟動(dòng)子A 區(qū)甲基化水平，增強(qiáng)細(xì)胞ERα mRNA表達(dá)，進(jìn)而促使成骨細(xì)胞增殖分化。因此，葛根素可能將是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療的一種有效藥物，并且與雌激素相比，它的不良反應(yīng)明顯較少，有利于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的長(zhǎng)期治療。

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(本文編輯：許卓文)

[收稿日期]2014-12-19；[修回日期]2015-01-06

[基金項(xiàng)目]甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題(GZK-2013-26)

[作者簡(jiǎn)介]呂海宏(1969-)，男，陜西西安人，蘭州大學(xué)第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事骨質(zhì)疏松疾病診治研究。

[中圖分類號(hào)]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)04-0385-06

Puerarin reduces methylation of estrogen receptor α promoter in osteoblasts and regulates its proliferation and osteoblastic differentiation

LV Hai-hong,TANG Xu-lei,FU Song-bo

(Department of Endocrinology,the First Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

[Abstract]ObjectiveThe study shows that puerarin regulates pathway of metabolism in osteoblasts and provides the theoretical foundation for treating methods of postmenopausal osteoporosis.MethodsCulture of primary calvarial osteoblasts in rats were digested,and used in experiments.Then,the cells were treated with different concentrations of puerarin(5,10,25,50,100 μmol/L) in different groups,respectively.The methylation status of CpG islands in estrogen receptor α(ERα) gene promoter region of genome DNA was analyzed by nested-methylation-specific PCR;ER-α gene mRNA expression was examined by semiquantitative reverse transcription PCR analysis.The proliferation and viability of osteoblasts were assayed by MTT assay using the spectrophotometric method.Furthermore,the differentiation of osteoblast-like cells by p-nitrophenyl phosphate were identified.ResultsThe cultured osteoblasts treated by puerarin with different concentrations reduced in de novo methylation in promoter region of ERα gene with a concentration-treating manner,and a dose-dependent raising effect on osteoblasts proliferation and differentiation(P<0.01).Meanwhile,ER-α gene mRNA expressions in osteoblasts treated by puerarin with different concentrations became stronger and stronger,until in the 25 μmol/L treating group,their expressions were the stongest(P<0.01).ConclusionPuerarin reduces DNA methylation in promoter region of ERα in osteoblasts and enhences ERα gene mRNA expressions in osteoblasts.Above results possible influence its proliferation and osteoblastic differentiation.

[Key words]osteoblasts;puerarin;dna methylation;estrogen receptor α