吳 桐1劉吉成1邱永強2李美謙1何 寧1李鴻梅1李喜春

全基因組相關(guān)研究SNP多態(tài)性陽性位點與黑龍江省女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)性研究

吳 桐1劉吉成1邱永強2李美謙1何 寧1李鴻梅1李喜春3

目的檢測前期GWAS研究中差異最顯著的三個位點多態(tài)性與黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)性。方法收集150例乳腺癌患者和300例年齡匹配且無乳腺癌家族史的健康體檢者一般臨床資料和5 ml外周靜脈血，提取基因組DNA，PCR/sequencing方法基因分型，統(tǒng)計并比較兩組研究對象各等位基因頻率及基因型頻率。結(jié)果各位點乳腺癌組和對照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0．05）；rs3006663，rs737495等位基因頻率分布及基因型檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；rs6551328基因型分布在病例對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），相對于CC基因型，CT雜合基因型的風(fēng)險值OR＝1．776，95%CI為1．155～2．728，提示該位點CT基因型是乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險因素。結(jié)論rs6551328多態(tài)性與在黑龍江漢族女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)。

乳腺癌，單核苷酸多態(tài)性SNP，易感位點，群體分布

乳腺癌是女性中排名首位的致病致死惡性腫瘤，近年來，乳腺癌發(fā)病呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命。乳腺癌是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的復(fù)雜疾病。流行病學(xué)調(diào)查表明，乳腺癌的發(fā)病呈明顯的家庭聚集現(xiàn)象，并在群體中表現(xiàn)出易感個體差異性和種族差異性，提示遺傳因素在乳腺癌的發(fā)病過程中起到重要作用［1］。然而，乳腺癌發(fā)病遺傳病因至今尚未明確，為乳腺癌的預(yù)防、早期診斷及治療帶來困難。近年來全基因組相關(guān)研究（GWAS）確定了大量的乳腺癌低共顯性遺傳易感位點，表明乳腺癌的遺傳易感性主要可能與常見的低共顯性易感基因和單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）變異有關(guān)。這些易感基因和易感位點有望作為腫瘤標(biāo)志物改善乳腺癌的風(fēng)險預(yù)測及早期診斷，為確定高危人群、尋找預(yù)警標(biāo)志物及個體化醫(yī)療提供理論依據(jù)。本文采用病例對照研究策略，選取黑龍江地區(qū)150乳腺癌病例和300例體檢健康病例作為對照，通過檢測前期GWAS研究中差異最顯著三個多態(tài)性位點，探討這些位點多態(tài)性與黑龍江地區(qū)乳腺癌易感性的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究經(jīng)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均自愿入組，簽署知情同意書。乳腺癌病例選自黑龍江地區(qū)2013年1月～2015年1月臨床收治漢族女性患者共計150例，（46.18±4.86）歲，為經(jīng)病理組織學(xué)確診患者；300例對照選自臨床體檢健康漢族女性，（44.92±5.21）歲。排除既往有放化療史，其他腫瘤病史，自身免疫系統(tǒng)疾病史，精神病史，內(nèi)分泌疾病史，職業(yè)暴露史，以及家族一級親屬患有乳腺癌、卵巢癌者，排除在黑龍江地區(qū)居住不滿15年者。收集每名參加者外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝保存，以備分析。

1.2 位點篩選

研究位點為rs3006663，rs737495，rs6551328，三個位點，篩選自本研究室前期以乳腺癌為研究對象，應(yīng)用Affimetrix SNP 6.0基因分型芯片（Affymetrix.Inc， 美國）完成的基于混合DNA全基因組相關(guān)研究結(jié)果，為病例—對照差異最顯著三個位點，其P值依次分別為3.374×10-8，8.981×10-8，9.212×10-8。

1.3 基因分型

1.3.1 材料和試劑 全血基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP348-03），引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成，2×EasyTaq PCR Super Mix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（AS111-12），DNA 測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.3.2 基因分型 本研究采用PCR/Sequencing方法鑒定基因型，全血基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒提取，經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度和純度，并將DNA工作液稀釋至（50±2）ng/μl。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，引物序列詳見表1；PCR擴增體系為：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μl，2pM上下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，超純水9.5 μl；擴增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序。

表1 各位點引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果用DNAstar軟件判讀，Hardy-Weinberg平衡用Haploview軟件計算，統(tǒng)計分析用SPSS 18.0軟件分析， 基因頻率和基因型頻率分布用χ2檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 各位點Hardy-Weinberg平衡分析

經(jīng)檢驗，各位點乳腺癌組和對照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），說明研究對象在遺傳學(xué)方面可以代表本地人群。

2.2 各位點基因型頻率及基因頻率分析

三個位點基因型頻率分布見表2所示，位點rs6551328各基因型在病例、對照兩組分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，三個位點基因頻率分布未顯示顯著差異。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球呈上升趨勢，目前，全球每年約有120萬新發(fā)乳腺癌病例，約有50萬婦女死于乳腺癌，乳腺癌嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命。中國是乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一，且呈年輕化趨勢。因此有必要在婦女人群中開展針對風(fēng)險因素的評估，準(zhǔn)確找到高危人群范圍以便更好的進行針對性的預(yù)防指導(dǎo)。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的致病機理目前尚不明了。在復(fù)雜疾病風(fēng)險因素的研究中，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）成為一個非常行之有效的方法。GWAS通過對大量的病例對照及成千上萬個SNP位點分析，評估在不同的染色體上的SNP位點與疾病的關(guān)系， 從而找出新的乳腺癌易感位點。在GWAS研究技術(shù)問世之前，研究人員已通過家系相關(guān)研究和候選基因途徑等，篩選出某些與乳腺癌易感相關(guān)基因，但盡管這些基因與乳腺癌高風(fēng)險有關(guān)，但這些突變在人群中非常少，也只能解釋極小部分基于家系的乳腺癌患者的遺傳病因?qū)W。GWAS技術(shù)的問世讓我們找到了許多未曾發(fā)現(xiàn)的基因以及染色體區(qū)域，為復(fù)雜疾病的發(fā)病機制提供了更多的線索，通過GWAS研究篩選乳腺癌易感性單核苷酸多態(tài)性（SNP）成為乳腺癌遺傳病因?qū)W的一個熱點［2］。目前，國外對于乳腺癌易感位點的研究與驗證多以歐美人群為研究對象，大量的乳腺癌低共顯性遺傳易感性位點，表明乳腺癌的遺傳易感性主要可能與常見的低共顯性基因的變異有關(guān)［3］。然而，目前尚不清楚低外顯率等位基因的確切數(shù)目及其影響乳腺癌易感性的機制。

表2 各位點基因型頻率及基因比較

而我國針對與乳腺癌相關(guān)的各種危險因素（流行病學(xué)危險因素、乳腺病理危險因素和相關(guān)生物標(biāo)志物檢測）已經(jīng)進行了較多的研究，但對于乳腺癌的易感位點的發(fā)現(xiàn)及基于易感位點建立風(fēng)險預(yù)測模型研究尚處于起步階段。僅Zhangwei等人通過對7 531例乳腺癌患者和3 998例健康對照者進行全基因掃描分析發(fā)現(xiàn)了1個中國人群的乳腺癌易感位點 rs2046210［4］，和Lianjie等通過對1 049例中國人群乳腺癌患者和1 073例健康對照者的乳腺癌易感基因FGFR2的多態(tài)性位點進行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了2個乳腺癌易感位點rs1219648和rs2420946［5］。相對于國外此類研究，我國乳腺癌SNP易感位點研究較少。我們在前期北京漢族女性人群的GWAS研究中已獲得了若干個P＜5.0×10-8的乳腺癌易感相關(guān)SNP位點，本研究為在黑龍江省女性人群中驗證rs3006663，rs737495，rs6551328三個差異最顯著位點，發(fā)現(xiàn)rs6551328基因型分布在病例對照組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），相對于CC基因型，CT雜合基因型的風(fēng)險值OR＝1.776， 95%CI為1.155～2.728，提示該位點CT基因型可能是黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險因素。

研究現(xiàn)狀表明，欲闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的致病機理仍任重道遠(yuǎn)，未來欲了解乳腺癌的致病機理還將更多的依賴對乳腺癌低風(fēng)險易感基因多態(tài)性及其相互作用的研究。

［1］Nasim Mavaddat，Antonis C．Antoniou，Douglas F．Easton，et al．Genetic susceptibility to breast cancer［J］． Molecular Oncology，2010，4（3）：174-191．

［2］吳桐，劉吉成． 乳腺癌易感基因研究現(xiàn)狀［J］． 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，31（7）：579-582．

［3］Turnbull C，Ahmed S，Morrison J，et al． Genome-wide association study identifies five new breast cancer susceptibility loci［J］． Nat Genet， 2010，42（6）：504-507．

［4］Zhang W，Long JR，Gao YT，et al． Genome-wide association study identifies a new breast cancer susceptibility locus at 6q25．1［J］．Nat Genet，2009，41（3）：324-328．

［5］Liang J，Chen P，Hu Z，et al． Genetic variants in fibroblast growth factor receptor2 （FGFR2） contribute to susceptibility of breast cancer in Chinese women［J］． Carcinogenesis，2008，29（12）：2341-2346．

Association Study Between Positive SNP Polymorphism Loci of GWAS and Breast Cancer in Female of Heilongjiang Province

WU Tong1LIU Jicheng1QIU Yongqiang2LI Meiqian1HE Ning1LI Hongmei1LI Xichun31 Research Institute of Medicine & Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China，2 Public Health School，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China，3 The Third Affiliated Hospital，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China

ObjectiveTo analyze the correlation of three most significant loci polymorphism from preliminary GWAS results and the attack of Breast Cancerin female of Han group in Heilongjiang province．Methods150 breast cancer patients and 300 cases of age matched healthy controls without breast cancer were recruited from clinic． General clinical data and 5 ml peripheral venous blood from each cases were collected． Genomic DNA was extracted by kit． PCR/sequencing was used for genotyping． Allele frequency and genotype frequency was analyzed for comparison in both groups．ResultsThe genotype frequency distribution of each loci in case and control groups conformed to the Hardy-Weinberg genetic balance law． Statistical difference was not detected in allele frequency and genotype frequency of rs3006663 and rs737495（P＞0．05）． Genotype distribution of rs6551328 showed significant difference in both groups（P＜ 0．05）． Compared with CC genotype，the OR value of CT genotypes was 1．776， 95%CI was 1．155～ 2．728，suggested that CT genotypes might be the risk factor of breast cancer．Conclusionrs6551328 loci polymorphism associated with the attack of Breast Cancer in female of Han group in Heilongjiang province

Breast Cancer，Single nucleotide polymorphism， Susceptibility loci，Population distribution

R737．9

B

1674-9316（2015）27-0005-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．004

1 160006 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院；2 160006 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院；3 160006 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院

黑龍江省科技廳攻關(guān)項目（編號：GC12C304-3）；黑龍江省教育廳資助項目（編號：12531829）；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院“重大預(yù)研基金”項目