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        HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A含量及其藥動學研究

        2015-12-27 01:56:13張妍解軍波張彥青
        食品研究與開發(fā) 2015年3期
        關鍵詞:藥動學酸棗仁皂苷

        張妍,解軍波,張彥青,*

        (1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院制藥工程系,天津300134;2.天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

        HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A含量及其藥動學研究

        張妍1,2,解軍波1,2,張彥青1,2,*

        (1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院制藥工程系,天津300134;2.天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

        建立高效液相色譜-質譜串聯(lián)(HPLC-MS/MS)法檢測大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量,并應用于藥動學研究。大鼠靜注(4mg/kg)或灌胃(20mg/kg)給藥,不同時間取血,血漿樣品經處理后,采用HPLC-MS/MS法測定酸棗仁皂苷A含量,色譜柱為Waters YMCTM ODS-AQ S-5 120A(2.0×100mm)分析柱,以電噴霧離子化串聯(lián)質譜(ESI)及多反應監(jiān)測掃描模式(MRM)進行檢測,流動相為甲醇-水(0.1%甲酸)=50∶50,流速為0.3mL/min,柱溫為30℃,根據(jù)測定結果求算藥物的藥動學參數(shù)。酸棗仁皂苷A在40 ng/mL~4 000 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好(r2=0.999 1),各濃度水平的精密度及穩(wěn)定性的RSD均小于15%,提取回收率均大于85%。大鼠注射給藥后主要藥動學參數(shù)分別為Ke0.28/h,t1/22.55 h,AUC0→t2 839.89 h·ng/mL,AUC0→∞3 201.51 h·ng/mL,灌胃給藥后主要藥動學參數(shù)分別為Ke0.51/h,t1/21.35 h,AUC0→t206.02 h·ng/mL,AUC0→∞211.13 h·ng/mL。經計算,酸棗仁皂苷A在大鼠體內的生物利用度為1.32%。本試驗所建立的檢測方法快速簡便、精密度好、靈敏度高及穩(wěn)定性好,適用于酸棗仁皂苷A在大鼠體內血藥濃度測定及藥代動力學的研究。

        酸棗仁皂苷A;藥動學;高效液相色譜-質譜串聯(lián);生物利用度

        酸棗仁是鼠李科植物酸棗(Ziziphus psinosa Hu)的干燥成熟種子,具有斂汗、養(yǎng)肝、寧心安神等多種功效[1]。酸棗仁皂苷A((Jujuboside A,JuA)是酸棗仁的有效成分之一,具有鎮(zhèn)靜、催眠,降壓、降脂、抗缺氧、增強免疫功能以及對心臟的保護等廣泛的藥理效應,其應用前景十分誘人[2-4]。本研究建立了HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量并對其藥動學進行了研究。研究結果顯示建立的方法快速簡便、精密度好、靈敏度高及穩(wěn)定性好,適用于大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量測定。

        1 儀器與試藥

        Agilent 1100 Series高效液相色譜儀、G1322A在線脫氣機、G1312B二元泵、G1316B柱溫箱、G1315C DAD紫外檢測器、G1367D自動進樣器、Masshunter色譜工作站:Agilent,USA;BP211D型十萬分之一電子天平:Satorius,Germany;ZH-2型渦流混合器:天津大學無線電廠;AS10200A型超聲波清洗器:昆山超聲儀器有限公司;酸棗仁皂苷A對照品購自中國食品藥品檢定研究院;甲酸(96%)購自美國Tedia公司;色譜純甲醇與超純水均購自J.T.Baker公司。

        Wistar雄性大鼠體重(200±20)g(天津藥物研究所),給藥前禁食24h,不禁水,大鼠血漿由實驗室制備。

        2 方法與結果

        2.1 分析條件

        2.1.1 色譜條件

        色譜柱為:Waters YMCTMODS-AQS-5 120A(2.0× 100mm),柱溫為30℃,流動相為(0.1%甲酸溶液)-甲醇(50∶50);流速0.3mL/min,進樣量為20μL。

        2.1.2 質譜條件

        離子源:電噴霧ESI(-)源,檢測方式:多反應檢測(MRM),電噴霧電壓:4 000 V,霧化氣體:N2,霧化氣壓力:35Pa;干燥氣體:N2,干燥氣流速:8 L/min;離子源溫度:350℃,碰撞氣體:高純氮氣,碰撞氣壓力:0.15MPa。酸棗仁皂苷A的質譜分析的條件參數(shù)如表1。

        表1 酸棗仁皂苷A質譜分析的條件參數(shù)Table1 Parameter of Mass Spectra of Jujuboside A

        按前述色譜和質譜條件對血漿樣品中酸棗仁皂苷A的含量進行測定,記錄色譜圖。圖1和圖2分別為酸棗仁皂苷A對照品、空白血漿樣品及樣品中酸棗仁皂苷A的MS2-Scan全掃描色譜圖及目標化合物的MRM色譜圖。由圖可知樣品中酸棗仁皂苷A峰型良好,方法具有較好的分離度和靈敏度,可以進行定量分析。

        圖1 酸棗仁皂苷A的MS2-Scan全掃描色譜圖Fig.1 Representative M S2-Scan Chromatograms of JuA

        圖2 酸棗仁皂苷A樣品的MRM色譜圖Fig.2 Representative MRM Chromatograms of JuA

        2.2 對照品貯備液的配制

        精密稱量酸棗仁皂苷A對照品10mg,置10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻后即得濃度分別為1mg/mL的對照品溶液。

        2.3 供試品溶液的制備

        精密量取酸棗仁皂苷A對照品溶液100μL置1.5mL離心管中,揮干后加入100μL大鼠空白血漿,渦旋混勻,再加入甲醇溶液200μL,渦旋10 min,6000 r/min離心10min,取200μL上清置干凈的1.5mL離心管中,補加100μL水,渦旋5min混勻,過濾后即得供試品溶液。

        2.4 標準曲線的制備

        取適量1mg/mL酸棗仁皂苷A對照品溶液用甲醇稀釋,配制成40、80、200、400、800、1000、2000和4 000 ng/mL系列濃度的供試品溶液,按照2.3項所示方法進行處理,按前述色譜和質譜條件測定。以樣品濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸,得標準曲線方程。酸棗仁皂苷A在40 ng/mL~4 000 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好,標準曲線方程為Y= 4.75X+36.35,r2=0.999 1。

        2.5 精密度試驗

        按照2.3項制備方法,制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液,精密吸取供試品溶液20μL進樣,連續(xù)進樣5次,計算得酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為4.43%、2.12%和1.92%,表明精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性試驗

        按照2.3項制備方法,制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液,于-20℃條件下保存,測定樣品時,在室溫條件下放置融化樣品。分別于0、3、6、12、24、48 h進行分析,測定色譜峰面積,計算得各濃度水平的酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為9.17%、6.82%和4.76%,表明穩(wěn)定性良好。

        2.7 重現(xiàn)性試驗

        按照2.3項制備方法,制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液各5份供試液,依法測定,計算得各濃度水平的酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為7.26%、4.43%和3.97%,表明重現(xiàn)性良好。

        2.8 提取回收率試驗

        按照2.3項制備方法,制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液測定酸棗仁皂苷A的含量。再分別取40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的酸棗仁皂苷A對照品溶液100μL于1.5mL離心管中揮干,分別加入按照2.3法處理的未加藥的空白血漿200μL,補加100μL水后,搖勻,過濾后進樣測定酸棗仁皂苷A的含量。按照公式(1)計算得大鼠血漿中酸棗仁皂苷A提取回收率分別為85.64%、91.64%和86.69%,表明該方法提取回收率良好。

        3 藥動學研究

        取Wistar大鼠10只,隨機平均分為尾靜脈注射給藥組和口服灌胃給藥組,用乙醚使之輕度麻醉,將新鮮配制的酸棗仁皂苷A標準品生理鹽水注射劑對大鼠分別進行尾靜脈注射(劑量為4mg/kg)和口服灌胃給藥(劑量為20mg/kg),給藥后立即使之清醒。尾靜脈給藥組給藥后于10、30min、1、1.5、2、3、4、6 h和8 h經大鼠眼底靜脈叢采血約400μL~500μL,注入含有0.1%肝素鈉的抗凝管中輕搖混勻,6 000 r/min離心10min后取上層血漿。口服灌胃給藥組給藥后于10、30min、1、1.5、2、3、4、6、8 h和10 h經大鼠眼底靜脈叢采血后同上處理方法分離血漿。按照2.3法處理血漿樣品,測定血漿中的藥物濃度,計算相應藥動學參數(shù)和平均血藥濃度-時間曲線,如表2和圖3所示。

        表2 大鼠給藥后酸棗仁皂苷A藥動學參數(shù)Table2 The pharmacokinetic parameters of JuA in rats following intravenous administration and oral administration of JuA

        圖3 兩種不同給藥途徑的平均血藥濃度-時間曲線Fig.3 Mean(±SD)plasma concentration-time profiles of JuA

        4 討論

        本試驗建立了準確靈敏且快速的高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術(HPLC-MS/MS)來測定大鼠血漿樣品中酸棗仁皂苷A的濃度。結果顯示,大鼠血漿樣品中的酸棗仁皂苷A在40 ng/mL~4 000 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好,各濃度水平的精密度及穩(wěn)定性的標準偏差均小于15%,提取回收率均大于85%,由此說明藥物經本方法處理后性質穩(wěn)定,符合血漿樣品分析的各項要求,適用于大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量測定。

        本研究以Wistar大鼠為實驗動物,以尾靜脈注射給藥方式作為對照,研究酸棗仁皂苷A灌胃給藥后,藥物在大鼠體內的藥代動力學過程。結果表明,酸棗仁皂苷A在大鼠體內呈現(xiàn)線性動力學特征,但該藥物經灌胃給藥后的生物利用度很低,初步推測藥物可能是以原型的形式或發(fā)生某種轉化后大量存在與胃腸道中,或是通過其他途徑發(fā)揮藥效作用,具體結論仍需進一步實驗對其進行佐證。

        [1] 中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010

        [2]Shea J L,Mochizuki T,Sagvaag V,et al.Rapid eye movement(REM) sleep homeostatic regulatory processes in the rat:changes in the sleep-wake stages and electroencephalographic power spectra[J]. Brain Research,2008,1213:48-56

        [3] Wang X H,Li Z,Wang X.Sedative and hypnotic effects of suanzaoren decoction in different dose[J].Journal of Shanxi College Traditional Chinese Medicine,2006,7:19-20

        [4] Cao J X,Zhang Q Y,Cui SY,et al.Hypnotic effect of jujubosides from Semen Ziziphi Spinosae[J].Journal of Ethnopharmacology, 2010,130:163-166

        Determination of Jujuboside A in Rat Plasm a by HPLC-MS/M S and Its Pharmacokinetics Study

        ZHANG Yan1,2,XIE Jun-bo1,2,ZHANG Yan-qing1,2,*
        (1.Tianjin University of Commerce,School of Biotechnology and Food Science,Department of Pharmaceutical Engineering,Tianjin 300134,China;2.Tianjin Key Laboratary of Food Biotechnology,Tianjin 300134,China)

        To establish a method for the determination of the concentration of Jujuboside A(JuA)in rat plasma by liquid chromatography-mass/mass spectrometry(HPLC-MS/MS),and study its pharmacokinetics.The rats were intravenously (4 mg/kg)or oral(20 mg/kg)administrated JuA.Blood samples were drawn from the palpebra at different stages.The concentrations of JuA in the plasma were determined by the HPLC-MS/MS method.Chromatographic separation was carried out with a security guard Waters YMCTM ODS-AQS-5 120A(2.0×100 mm)(Waters,USA).HPLC-MS/MS was performed on a triple-quadrupole mass spectrometry equipped with electrospray ionization(ESI)and negative multiple reaction monitoring (MRM).The mobile phase consisted of methanol-water-formic acid (50∶50∶0.1),delivered at the flow rate of0.3mL/min under 30℃.The method was linear over the concentration range of 40 ng/mL-4 000 ng/mL(r2=0.999 1).The relative standard deviations of the assay were less than 15.0%for the low,and the recovery of the method was more than 85%.The pharmacokinetic parameters were as follows:Ke0.28/h,t1/22.55 h,AUC0→t2 839.89 h·ng/m L,AUC0→∞3 201.51h·ng/mL in rat with intravenous administration,and Ke0.51/h,t1/21.35h,AUC0→t206.02h·ng/mL,AUC0→∞211.13 h·ng/mL in rat with oral administration.The bioavailability of JuA was1.32%.The developed method was successfully applied to the estimation of the pharmacokinetic parameters of JuA.

        Jujuboside A;pharmacokinetic;HPLC-MS/MS;bioavailability

        10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.028

        2013-11-22

        張妍(1987—),女(漢),碩士研究生,從事生物活性物質的分離篩選的研究工作。

        *通信作者:張彥青(1974—),女(漢),副教授。

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