鄭洪艷，蘇寧，霍彤，趙丹，王昌濤，*，楊麗

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100123；2.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京100048）

藍莓葉總黃酮的純化及抗脂質(zhì)過氧化能力研究

鄭洪艷1，蘇寧1，霍彤2，趙丹2，王昌濤2，*，楊麗1

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100123；2.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京100048）

以靜態(tài)吸附量和解析率為評價指標(biāo)，對5種大孔吸附樹脂對藍莓葉黃酮的純化效果進行比較。結(jié)果表明DM-130吸附樹脂效果最好，吸附量達到71.5mg/g，解析率達到74.41%。純化后的黃酮純度達到68.8%。以抗壞血酸為對照，考察藍莓葉黃酮對油脂氧化的抑制能力，結(jié)果顯示其半數(shù)抑制濃度（IC50）為78.46μg/mL，顯著強于抗壞血酸（IC50為5.56mg/mL）。

總黃酮；大孔樹脂；純化；抗脂質(zhì)過氧化

黃酮類化合物的純化分離主要是通過溶劑萃取法及離子交換樹脂法等方式，但這些方法都具有其自身的缺點。溶劑萃取法應(yīng)用過程中溶劑的殘留量大，處理不徹底，會有溶劑殘留，嚴(yán)重影響后續(xù)的工藝。離子交換樹脂法則需引入可進行交換的酸性或堿性基團，處理量小，提取率低。對黃酮類化合物而言，弱極性樹脂吸附量大，分離度好，解吸容易，處理量高[1-2]。近年來，提純黃酮類化合物主要有HP-20系列、DA201、DM103和AB-8等樹脂。因為黃酮類化合物本身的極性較小，而且可以和樹脂骨架分子形成氫鍵，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更適合黃酮類化合物的分離純化[3]。

抗氧化物質(zhì)與促氧化物質(zhì)的平衡遭到破壞而令機體細(xì)胞長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生有毒性的氧化產(chǎn)物會干擾細(xì)胞正常功能，引發(fā)炎癥（inflammation），加速人體細(xì)胞的衰老或各種慢性疾病的發(fā)生。黃酮類化合物具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老[4]，調(diào)節(jié)機體免疫及炎癥反應(yīng)等多種生理活性及功效[5-6]。通過抗油脂氧化試驗，測定藍莓葉黃酮的抗氧化活性，同時與其他抗氧化劑（VC）的抗氧化活性進行比較，探討藍莓葉黃酮提取物的抗氧化能力。為生產(chǎn)實踐中提高藍莓葉黃酮的附加值提供新思路。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-301）：上海互佳儀器有限公司；SHZ-CD型循環(huán)水真空泵：上海貝倫儀器設(shè)備有限公司。

色譜系統(tǒng)：Waters Empower色譜系統(tǒng)由Waters 1525二進制高效液相色譜泵、Waters2707自動進樣系統(tǒng)、Waters 2489 UV/VIS檢測器和 Empower軟件、Windows XP系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)收集處理。

1.2 試劑

藍莓葉購于江蘇沃田農(nóng)業(yè)有限公司。十二烷基硫酸鈉（SDS）和Brij-35（聚氧乙烯（23）月桂醚）為分析純級別，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度98%，以上試劑均購于阿拉丁試劑公司：中國上海。DPPH、卵磷脂溶液、硫酸亞鐵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、HCl、六氰合鐵酸鉀溶液（K3Fe（CN）6）、鄰苯三酚、H2O2、水楊酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等，分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；AB-8、DM130、DM301、NKA-9和HPD-100樹脂：北京迪朗生化科技有限公司。各種樹脂物理性能列于表1。

表1 樹脂物理性質(zhì)比較Table1 The physical property of macroporous adsorptive resins

2 方法

2.1 大孔樹脂分離純化方法

2.1.1 樹脂的預(yù)處理

1）每組取樹脂50 g浸漬于500mL 95%乙醇30 h。

2）用75%乙醇洗滌樹脂，至流出液加水不呈白色混濁為止，再用去離子水浸泡樹脂并洗滌，洗凈至無乙醇味兒。

3）用250mL 5%HCl溶液浸泡樹脂5 h，而后用去離子水洗至水pH中性。

4）用250mL2%NaOH溶液浸泡樹脂5 h，而后用去離子水洗至水pH中性。

2.1.2 藍莓葉總黃酮提取物的制備

60℃干燥恒重藍莓葉，粉碎后過50目篩待用。以料液比1∶25（g/mL）60%乙醇溶液，80℃回流提取2次，90min/次，過濾，合并濾液。將濾液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或者冷凍干燥，得到藍莓葉黃酮粗提物。實驗過程中按所需加蒸餾水充分?jǐn)嚢枞芙膺^濾，即得藍莓葉提取液。

2.1.3 黃酮含量的測定

精密量取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，配制成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法進行測定[7-8]。在510 nm下測其吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

移取供試品溶液1mL置于10mL容量瓶中，以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法進行測定，80%的乙醇定容作空白參比在510 nm下測吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項下的回歸方程計算總黃酮的提取率。

式中：n為稀釋的倍數(shù)；C為總黃酮的濃度，（mg/mL）；V為溶液的體積，mL；m為添加的原料質(zhì)量，mg；X總黃酮的提取率；樣品含量換算成mg/g表示。

2.1.4 樹脂的篩選靜態(tài)吸附

取5種處理好的大孔樹脂各10 g，分別加入藍莓葉提取溶液30mL，放置于室溫?fù)u床中，每10分鐘分別取各樹脂吸附后的溶液于510 nm處測定吸光度，計算室溫下各種樹脂對藍莓葉黃酮的吸附量（mg/g）和吸附率（mg/g）[9]。

式中：Q為吸附量，（mg/g）；C0為藍莓葉提取液總黃酮初始濃度，（mg/mL）；C1為吸附后溶液中剩余總黃酮濃度，（mg/mL）；V為溶液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g。

2.1.5 樹脂的篩選靜態(tài)解析

藍莓葉提取溶液于510 nm下測定吸光值，作為初始值。利用大孔吸附樹脂對其進行靜態(tài)吸附，在一定時間內(nèi)間隔固定時間取樣測定。靜態(tài)吸附后的樹脂過濾紙上抽干。用60%乙醇作為解吸液，按照一定的比例添加。將其置于搖床中，在室溫條件下進行解析，在間隔一定時間內(nèi)取解吸液1m L，測定其510 nm處吸光值，計算各種樹脂對藍莓葉黃酮的解析率（%）。

2.2抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

將10mg/mL卵磷脂溶液1mL、0.4mmol/L硫酸亞鐵1mL及1mL樣品溶液依次加入到試管中并混勻。37℃水浴并進行避光處理60min，加入TCA-TBAHCl 2 mL混合液，95℃水浴15 min后立即冷卻，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10m in，棄去沉淀，保留上清液，測定其在535 nm測吸光度（As）?？瞻坠芤?mL去離子水作為樣品使用，測得空白管的吸光度（Ac），參比管中以1m L去離子水作為卵磷脂使用。并以抗壞血酸作為陽性的對照[10]。

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)進行作圖，通過得到的擬合方程計算出能夠到達50%抑制率時所需要添加的樣品濃度，其數(shù)值即半抑制濃度IC50值。

3 結(jié)果與討論

3.1 大孔樹脂的篩選

對藍莓葉黃酮的靜態(tài)吸附量和解析率是篩選大孔樹脂的主要指標(biāo)。表2為5種大孔吸附樹脂對藍莓葉中總黃酮的靜態(tài)吸附及解吸性能結(jié)果。

表2 吸附樹脂對藍莓葉黃酮的吸附率及吸附分離處理后黃酮含量（25℃）Table 2 Macroreticular resins absorption rate and flavonoids content in extracts

AB-8，DM130樹脂解吸率較高，而DM130樹脂解析率和吸附量都大于AB-8樹脂。由于吸附是一個可逆的過程，吸附解吸是處于動態(tài)平衡當(dāng)中的。由表2可看出，由于樹脂極性不同，解吸的難易也不同。若樹脂的靜態(tài)吸附量大，則分離效果好；但若吸附過強，解析就會很難進行或者需要的條件苛刻，解析時間過長。因此做樹脂的類型選擇的時候，要結(jié)合吸附量和解吸率來選擇樹脂。因此選用DM130樹脂純化藍莓葉總黃酮。

3.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

對DM130大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)進行了研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 DM 130靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Kinetics curve of static adsorption of DM 130 macroporous resins

DM130樹脂對藍莓葉總黃酮的吸附為快速平衡型，即在起始階段吸附量比較大，在4 h內(nèi)基本接近達到平衡。DM130樹脂對藍莓葉總黃酮具有良好的靜態(tài)吸附動力學(xué)特性，較適宜藍莓葉總黃酮純化。

3.3 DM130大孔吸附樹脂純化藍莓葉總黃酮的工藝驗證結(jié)果

綜合以上實驗結(jié)果，確定藍莓葉總黃酮純化工藝條件：取500mL質(zhì)量濃度為300mg/mL的藍莓葉黃酮溶液，準(zhǔn)確稱取經(jīng)50 g預(yù)處理過的DM130樹脂，在25℃下恒溫振蕩吸附4 h。以60%乙醇為洗脫劑，進行靜態(tài)洗脫。按照此工藝條件，利用DM130大孔吸附樹脂對藍莓葉總黃酮分離純化，進行重復(fù)試驗，結(jié)果見表3。

表3 藍莓葉總黃酮的純化Table3 Purifiction of total flavonoids

從表3中結(jié)果可知，重復(fù)實驗的藍莓葉總黃酮純化純度與解析率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.37%，0.48%，說明工藝重復(fù)性較好，較穩(wěn)定，可用于藍莓葉總黃酮的分離與純化。

3.4 藍莓葉總黃酮的抗脂質(zhì)過氧化能力測定

藍莓葉黃酮與抗壞血酸的抗脂質(zhì)過氧化能力曲線如圖2、圖3所示。

圖2 藍莓葉黃酮的量與其抗脂質(zhì)過氧化能力關(guān)系（%）Fig.2 The capability of flavonoid from blueberry leaveson inhibiting lipid peroxidation

圖3 抗血酸抗?jié)舛扰c其抗脂質(zhì)過氧化能力（%）Fig.3 The capability of ascorbic acid on inhibiting lip id peroxidation

圖2中曲線表示藍莓葉黃酮添加量與其抗脂質(zhì)過氧化能力的關(guān)系，實驗考查可知藍莓葉黃酮從50μg/mL增加到250μg/mL的過程中，其抗脂質(zhì)氧化能力不斷提高。50μg/mL的藍莓葉黃酮濃度條件下，其抑制率為22.78%，100μg/mL的藍莓葉黃酮的濃度條件下，其抑制率增高73.35%，但是當(dāng)藍莓葉黃酮的濃度在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加時，其抑制率雖有所增長但很幅度不大。通過曲線擬合方程，算出其抗脂質(zhì)過氧化能力IC50的值為78.46μg/m L。

圖3中可以看出抗壞血酸濃度與其脂質(zhì)體過氧化的抑制作用關(guān)系，通過計算得出抗壞血酸濃度對抗脂質(zhì)過氧化能力差異顯著（P＜0.05），抑制率隨其濃度的增加而增大。圖2和圖3比較計算可以得出，藍莓葉黃酮抗脂質(zhì)過氧化能力（IC5078.46μg/mL）明顯優(yōu)于抗壞血酸（IC505.56mg/m L）。

4 小結(jié)

利用大孔吸附樹脂對藍莓葉黃酮進行分離、純化時，考察極性不同的樹脂對藍莓葉黃酮吸附性能的區(qū)別。實驗結(jié)果表明DM-130弱極性樹脂效果最好，其靜態(tài)吸附量達到71.5mg/g，解析率達到74.41%。這是由于其靜態(tài)吸附量為弱極性樹脂更有利于對藍莓葉黃酮的吸附，其具體表現(xiàn)為吸附量大，分離度好，而且解吸容易，得到的總黃酮含量高。藍莓葉黃酮酚羥基和糖苷鏈含量較高，極性小，通過與樹脂骨架分子形成氫鍵從而進行吸附和解吸；而DM130型的樹脂孔徑在0.90μm～1.00μm之間，藍莓葉黃酮通過其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以更好的進行分離、純化。利用DM130型的樹脂純化藍莓葉黃酮的參數(shù)為：藍莓葉黃酮上樣量500m L，上樣濃度為300mg/mL，預(yù)處理過的DM130樹脂50 g，25℃下恒溫振蕩吸附4 h。以60%乙醇為洗脫劑，進行靜態(tài)洗脫3 h。純化后所得黃酮純度達到68.8%。

以抗壞血酸為對照，測得藍莓葉黃酮對脂質(zhì)過氧化的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為78.46μg/mL，明顯高于抗壞血酸（IC50=5.56mg/mL），表明藍莓葉黃酮具有很強的抗脂質(zhì)過氧化能力。鐵離子可以使脂質(zhì)體發(fā)生氧化作用，其氧化過程中生成的過氧化物、自由基，會造成油脂氧化的進一步的氧化反應(yīng)。黃酮類物質(zhì)表現(xiàn)出的抗氧化活性，是通過與鐵離子結(jié)合對其進行螯合以及對自由基清除的綜合表現(xiàn)[11-12]，所以表現(xiàn)出抗脂質(zhì)過氧化能力高于抗壞血酸。

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Study on and Anti-Lipid Peroxidation Activity of Total Flavonoids in Blueberry Leaves

ZHENG Hong-yan1，SU Ning1，HUO Tong2，ZHAO Dan2，WANG Chang-tao2，*，YANG Li1
（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China；2.School of Science，Beijing Technology and Business University，Beijing100048，China）

In this study，five kinds of macroporous adsorption resins was chosen to compare their ability of flavonoids purification.The static adsorption and desorption of flavonoids is the main evaluation index.The result shows that the DM-130 macroporous adsorption resins was the best with an adsorption capability of 71.5 mg/g and a desorption rate of 74.41%.The purity of total flavonoids reach to 68.8%.The anti-lipid peroxidation of total flavonoids in blueberry leaves was tested with vitamin C as reference.The IC50of anti-lipid peroxidation is78.46μg/mL，which is much better than vitamin C（5.56mg/mL）.

total flavonoids；macroporous adsorption resins；purification；anti-lipid peroxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.008

2014-11-03

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項項目（201310132）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項項目（201410019）

鄭洪艷（1976—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：化妝品安全性、功效性評價研究。

*通信作者：王昌濤（1975—），男，教授，博士，研究方向：植物功效成分開發(fā)應(yīng)用。