楊慧文，張旭紅，陳健媚，潘育方，*，錢(qián)婧

（1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510006；2.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院文理系，江蘇揚(yáng)州225000）

白簕葉不同極性部位的體外抗氧化活性分析

楊慧文1，張旭紅1，陳健媚1，潘育方1，*，錢(qián)婧2

（1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510006；2.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院文理系，江蘇揚(yáng)州225000）

利用不同溶劑對(duì)白簕葉各極性部位進(jìn)行提取、顯色鑒定和薄層色譜分析，并考察其中乙酸乙酯、正丁醇和水3個(gè)不同極性部位提取液的體外抗氧化活性，通過(guò)測(cè)定其鐵還原力、對(duì)DPPH·的清除率、總抗氧化力，篩選出主要的抗氧化活性部位。結(jié)果表明，白簕葉3個(gè)不同極性部位的成分的種類(lèi)和含量差別均較大，體外抗氧化結(jié)果顯示各部分體外抗氧化活性也存在較大差異，其中正丁醇部位抗氧化活性最高。

白簕葉；黃酮；抗氧化活性

白簕Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.，為五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanan）攀援狀灌木，又稱(chēng)鵝掌簕、刺三加、白刺尖，分布于兩廣、福建、云南、貴州等地，東南亞如泰國(guó)、越南等也有分布[1]。白簕味苦、辛、涼，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、止咳平喘、散瘀止痛之功效[2-3]，其主要化學(xué)成分為槲皮甙、黃酮、多糖、咖啡?？鼘幩岬萚4-6]。經(jīng)研究，白簕具有消炎抑菌、防齲固齒、治療新生兒濕疹等作用[7-9]。五加屬植物多有抗氧化作用，刺五加可抑制鼠巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生[10]，其莖提取物在四氯化碳中毒大鼠模型中具有抗氧化功效[11]。而白簕同為刺五加屬，其抗氧化功效，尤其是關(guān)于其活性部位的篩選，少有研究。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定鐵還原力、對(duì)DPPH的清除率、總抗氧化力[12-14]，將測(cè)定結(jié)果與維生素C進(jìn)行對(duì)比，從三個(gè)方面研究白簕葉不同極性部位的抗氧化活性，篩選抗氧化活性部位，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)白簕提取物的抗氧化功效提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

白簕莖購(gòu)自恩平響山簕菜茶廠(chǎng)（經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院中藥資源系劉基柱副教授鑒定為五加屬植物白簕，標(biāo)本保存于廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院標(biāo)本室）、鎂粉（40目～90目）：鶴壁市江浪金屬有限公司；DPPH.（分析純）：美國(guó)Sigma公司；維生素C（VC）（分析純）：天津市石英鐘廠(chǎng)霸州市化工分廠(chǎng)；三氯化鋁、磷酸三鈉、鉬酸銨、香草醛、三氯化鐵、硫酸、無(wú)水乙醇、正丁醇等均為分析純。

1.1.2 主要儀器

KQ5200超聲儀：東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠(chǎng)；HH-2恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；SHZD-DⅢ循環(huán)式水泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LD4-2A低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；UV-1200紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；萬(wàn)分之一天平：FA2104A上海精天電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

40 g白簕葉粉碎，過(guò)60目篩。200m L石油醚在50℃下攪拌提取1 h，抽濾，反復(fù)提取，直至提取液近于無(wú)色，將葉渣自然風(fēng)干；再用200mL氯仿在40℃下提取1 h，更換提取溶劑，共提8次，直至提取液近于無(wú)色，將葉渣自然風(fēng)干。

用200mL乙酸乙酯在50℃下攪拌提取該葉渣1 h，收集提取液，重復(fù)數(shù)次直至乙酸乙酯提取液顏色很淺，合并提取液，在40℃下減壓旋蒸，得白簕葉乙酸乙酯部位50mL。

自然風(fēng)干葉渣后，200 mL 95%乙醇超聲提取60 min，每次超聲20min，過(guò)濾，重復(fù)操作，至乙醇提取液近于無(wú)色，合并提取液，40℃下減壓旋蒸濃縮，用蒸餾水少量多次復(fù)溶，得白簕葉水提部位100mL。

用50mL水飽和正丁醇對(duì)上述水溶液進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，得正丁醇部位150mL。

將上述3個(gè)不同極性部位提取液在4℃下密封保存，備用。

1.2.2 顯色反應(yīng)

采用顯色反應(yīng)的方法，對(duì)1.2.1項(xiàng)下3個(gè)不同極性部位提取液進(jìn)行定性鑒定。

1.2.2.1 鹽酸-鎂粉反應(yīng)

分別取白簕葉各極性部位提取液2mL于不同試管中，各加入適量乙醇、少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，觀(guān)察顏色反應(yīng)。

1.2.2.2 堿性試劑顯色反應(yīng)

取兩張濾紙，均點(diǎn)上白簕葉各極性部位提取液，其中一張用濃氨水熏，與另外一張對(duì)比觀(guān)察顏色變化，于空氣中放置一段時(shí)間后，再觀(guān)察顏色變化。

1.2.2.3 鋁鹽反應(yīng)

分別取白簕葉各極性部位提取液2mL于不同試管中，各加入2滴1%AlCl3醇溶液，與對(duì)照管對(duì)比觀(guān)察顏色變化。用毛細(xì)管取樣點(diǎn)于硅膠板上，于紫外燈下觀(guān)察熒光。

1.2.2.4 Molish反應(yīng)

分別取白簕葉各極性部位提取液2mL于不同試管中，各加入適量乙醇，2滴α萘酚溶液，斜置試管，沿管壁加入濃硫酸約1mL，靜置，觀(guān)察二層溶液界面的變化。

1.2.2.5 三氯化鐵反應(yīng)

分別取白簕葉各極性部位提取液4mL于不同試管中，各加入1滴5%三氯化鐵溶液，與對(duì)照管對(duì)比觀(guān)察顏色變化。

1.2.2.6 三氯甲烷-濃硫酸檢驗(yàn)（Salkowski反應(yīng)）

分別取白簕葉各極性部位提取液1mL于不同試管中，各加入1m L三氯甲烷混勻，沿管壁加入等體積濃硫酸，與對(duì)照管對(duì)比觀(guān)察顏色的變化。

1.2.3 聚酰胺薄層色譜

取乙酸乙酯、正丁醇和水這3個(gè)部位的濃縮液于相同的聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，每個(gè)樣品點(diǎn)兩個(gè)點(diǎn)。使用正丁醇-乙酸-水-石油醚（4∶1∶1∶2）系統(tǒng)進(jìn)行展開(kāi)，于紫外燈下觀(guān)察展開(kāi)效果。用濃氨水作為顯色劑，同樣在紫外燈下觀(guān)察熒光效果。

1.2.4 體外抗氧化活性的測(cè)定

取一定體積白簕葉3個(gè)不同極性部位提取液各自減壓旋干后，用5mL 70%乙醇復(fù)溶，分別得到乙酸乙酯部位待測(cè)液（32、80、160、240、320mg/m L）5個(gè)濃度梯度，水部位待測(cè)液（13、17、24、40、60mg/mL）5個(gè)濃度梯度，以及正丁醇部位待測(cè)液（3.0、3.9、5.4、9.0、13.5mg/mL）5個(gè)濃度梯度。其中濃度代表每毫升提取液相當(dāng)于原藥材的質(zhì)量（mg）。

按照以下操作評(píng)價(jià)各部分樣品的總抗氧化力和鐵還原力、對(duì)DPPH·自由基清除率。制備濃度為20、30、40、50、60mg/mL的VC溶液作對(duì)比試驗(yàn)。

1.2.4.1 鐵還原力的測(cè)定

取待測(cè)液1m L置于試管中，加入2.5m L磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=6.6）和2.5mL 1%鐵氰化鉀，放入50℃水浴鍋中20min后取出急速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5mL。將上述溶液離心10min（3000 r/min），取上清液5mL。再加入4mL蒸餾水及1mL 0.1%FeCl3混勻，靜置10min后測(cè)定吸光值（λ=700 nm），吸光度值越大表明還原力越強(qiáng)[12]。

1.2.4.2 總抗氧化能力測(cè)定

取待測(cè)液1m L置于試管中，依次滴加1m L 0.6mol/L硫酸溶液、1.5mL 28mmol/L磷酸鈉、1.5mL 4mmol/L鉬酸銨，隨后向試管中加入0.6mL蒸餾水，搖勻。95℃水浴90min，取出急速冷卻。另取一支試管，加入除待測(cè)液外的上述溶液，作為空白對(duì)照。在λ=695 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.4.3 對(duì)DPPH．自由基清除率的測(cè)定

取2.0mL待測(cè)液、2mL 0.15mmol/L的DPPH·乙醇溶液加入試管，充分混勻后靜置30min。以70%乙醇作為空白對(duì)照，在517 nm下測(cè)定樣品吸光度。根據(jù)公式計(jì)算出3個(gè)不同極性部位提取液對(duì)DPPH·的清除率[13]。

式中：A0為2.0mLDPPH·溶液+2.0mL 70%乙醇吸光度值；A為樣品吸光度值；A1為2.0mL待測(cè)液+ 2.0mL 70%乙醇吸光度值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 顯色反應(yīng)

對(duì)白簕葉不同極性部位提取液進(jìn)行七個(gè)顯色反應(yīng)，從而定性鑒定不同部位中所含的物質(zhì)種類(lèi)，其結(jié)果如表1所示。

表1 白簕葉不同極性部位提取液顯色反應(yīng)結(jié)果Table 1 Chromogenic reaction of different fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

鹽酸-鎂粉反應(yīng)是檢查樣品中是否含有黃酮類(lèi)化合物的最常用方法之一。由于黃酮具有鄰酚羥基，可與鎂離子形成紅色或橙色絡(luò)合物。表中結(jié)果顯示除正丁醇部位提取液顯現(xiàn)紅色現(xiàn)象外，其余無(wú)明顯反應(yīng)，說(shuō)明正丁醇部位很可能含有黃酮類(lèi)物質(zhì)。

堿液反應(yīng)是在日光及紫外光下，通過(guò)紙斑反應(yīng)，觀(guān)察樣品用堿性試劑處理后的顏色變化情況，對(duì)于鑒別黃酮類(lèi)化合物有一定意義。其結(jié)果顯示，正丁醇部位斑點(diǎn)顏色由淡黃色變?yōu)辄S色，在空氣中放置，黃色逐漸褪去，進(jìn)一步驗(yàn)證了正丁醇部位黃酮類(lèi)化合物的存在。

同樣，鋁鹽反應(yīng)也是較為經(jīng)典的黃酮鑒別反應(yīng)，結(jié)果顯示正丁醇部位具有黃色熒光，說(shuō)明該部位黃酮類(lèi)化合物的存在。

Molish反應(yīng)常用于糖類(lèi)和苷的檢測(cè)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正丁醇部位和水提部位液在兩層溶液交界面均出現(xiàn)棕色環(huán)，乙酸乙酯部位不存在此現(xiàn)象，說(shuō)明正丁醇部位和水提部位可能含有苷類(lèi)物質(zhì)。

三氯化鐵反應(yīng)常用來(lái)判斷酚羥基的有無(wú)，酚羥基可與三氯化鐵中Fe3+形成配合物，顯藍(lán)紫色。香豆素類(lèi)常含有酚羥基，可與三氯化鐵形成綠色或墨綠色沉淀。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象顯示，經(jīng)三氯化鐵試驗(yàn)，正丁醇部位顯深藍(lán)色，水提部位顯淺墨綠色，乙酸乙酯部位顯淺綠色，說(shuō)明正丁醇部位、水提部位和乙酸乙酯部位可能均含有不同濃度的酚羥基。

Salkowski反應(yīng)用于鑒別甾體、三萜類(lèi)化合物陽(yáng)性現(xiàn)象為硫酸層呈現(xiàn)紅色或者藍(lán)色，氯仿層有綠色熒光。經(jīng)Salkowski反應(yīng)后，正丁醇部位的氯仿層有綠色熒光出現(xiàn)，而兩層溶液的交接出呈紅色；水提部位的氯仿層和兩溶液交界處分別出現(xiàn)淺綠色熒光和淺紅色，可初步判斷正丁醇部位和水提部位可能均含有不同濃度的三萜類(lèi)或甾體類(lèi)化合物。

2.2 聚酰胺薄層色譜

為進(jìn)一步驗(yàn)證乙酸乙酯、正丁醇和水這3個(gè)不同極性部位的成分，對(duì)3個(gè)部位進(jìn)行薄層鑒定，結(jié)果如下圖1。

圖1 聚酰胺薄層色譜結(jié)果Fig.1 Result of polyamide TLC chromatogram of different fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

由圖可見(jiàn)，3個(gè)部位熒光的位置和顏色都有所不同，同一區(qū)段不同部位的熒光強(qiáng)弱也不同，說(shuō)明3個(gè)部位所含的成分有明顯區(qū)別，但也存在一定的交叉。

2.3 白簕葉各極性部位的鐵還原力分析

還原力大小常作為評(píng)價(jià)抗氧化性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，具有較強(qiáng)還原力的樣品可使Fe3+還原為Fe2+。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同極性部位提取液的還原力，與VC進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 白簕葉不同極性部位樣品鐵還原力的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Reducing power of Fe3+of different polarity fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）M err.leaves

樣品還原鐵氰化鉀后，與Fe3+反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，生成量越多，吸光度越大，說(shuō)明樣品還原力越強(qiáng)。由圖2-A可知，白簕葉各極性部位和VC均表現(xiàn)出不同程度的鐵還原力，比較圖2-A各曲線(xiàn)可得，相同濃度下，正丁醇部位的鐵還原力最強(qiáng)，水提部位次之，乙酸乙酯部位的鐵還原力并不顯著。在吸光度為0.33～0.37之間時(shí)，正丁醇、水提、乙酸乙酯部位和VC的樣品濃度分別為3、13、320、40mg/mL。同樣鐵還原力強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的白簕葉不同極性部位提取液濃度差異較大，該現(xiàn)象可能是因?yàn)楦鞑课凰哂需F還原力的物質(zhì)種類(lèi)不同或含量不同造成的。

將正丁醇、水提部位以及VC三種樣品的鐵還原力比較得圖2-B，從圖中可見(jiàn)，隨著濃度的增加，正丁醇和水提部位樣品的吸光度均隨之增加，表明樣品的鐵還原力與濃度在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在較好的相關(guān)性，鐵還原力具有明顯的量效關(guān)系。正丁醇和水提部位的鐵還原力在試驗(yàn)范圍內(nèi)均高于VC。

2.4 白簕葉各部位的總抗氧化力

采用改良后的Prieto法測(cè)定白簕葉各部位抗氧化力，其原理是磷鉬酸銨被具有抗氧化性的物質(zhì)還原，得到最大吸收波長(zhǎng)為695 nm的磷鉬絡(luò)合物。物質(zhì)還原活性越強(qiáng)，即抗氧化性越強(qiáng)，生成物吸光度越大[15]，測(cè)定結(jié)果如圖3。

圖3 白簕葉各極性部位的總抗氧化力Fig.3 Total antioxidant activity of different polarity fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

圖3結(jié)果顯示，白簕葉不同極性部位對(duì)磷鉬酸銨均具有較好的還原能力。隨著樣品濃度的增加，各產(chǎn)物吸光度均逐漸增大，說(shuō)明濃度增加該還原能力逐漸增強(qiáng)，各極性部位的抗氧化力呈現(xiàn)了良好的量效關(guān)系。與經(jīng)典抗氧化劑VC相比，各極性部位對(duì)磷鉬酸銨的還原能力均強(qiáng)于VC。在濃度為40mg/mL以上時(shí)，3個(gè)極性部位的抗氧化能力強(qiáng)弱依次為，正丁醇部位＞水提部位＞乙酸乙酯部位＞VC。

2.5 白簕葉各部位對(duì)DPPH·自由基的清除率測(cè)定

DPPH·在是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，具有孤對(duì)電子，易自行結(jié)合成為穩(wěn)定的分子；其醇溶液呈紫色，最大吸收波為517 nm。當(dāng)加入抗氧化劑時(shí)，其單電子被配對(duì)，溶液顏色變淺，導(dǎo)致其吸光值下降。根據(jù)吸光度值的降低計(jì)算清除率，清除率越大，抗氧化性越強(qiáng)，從而評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力[16]，結(jié)果如圖4。

由圖4-A可得，白簕葉各極性部位對(duì)DPPH·均具有較好的清除能力，對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度的增加而逐漸增大，但當(dāng)濃度升高到一定值時(shí)，清除率上升明顯緩慢或不再上升。由圖4-B可得，在濃度低于9mg/mL時(shí)，正丁醇部位對(duì)DPPH·的清除具有較好的量效關(guān)系。當(dāng)濃度到達(dá)試驗(yàn)范圍最高值時(shí)，正丁醇、水和乙酸乙酯三個(gè)部位對(duì)DPPH·的清除率分別為97.40%、86.05%和90.10%，與VC的最高清除率92.43%均較為接近。其中正丁醇部位對(duì)DPPH·的清除能力，無(wú)論是最佳清除效果還是低濃度時(shí)的清除率，均高于經(jīng)典抗氧化物VC。而乙酸乙酯和水提部位在低濃度時(shí)的清除能力和最佳清除效果均低于VC。總體來(lái)說(shuō)，各樣品的清除能力依次為，正丁醇部位＞VC＞水提部位＞乙酸乙酯部位。該現(xiàn)象可能由于正丁醇部位中對(duì)DPPH·有清除能力的物質(zhì)活性較強(qiáng)或含量較高。

圖4 白簕葉不同極性部位樣品對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Scavenging capacities for DPPH·of different polarity fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.Leaves

3 討論

五加屬（Acanthopanan）植物是一類(lèi)藥用價(jià)值較高的植物，大多分布在亞洲，其中的刺五加更是有“木本人參”的稱(chēng)號(hào)，臨床上具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神等功效[17]。白簕是五加屬中的一種，由于其兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在產(chǎn)地已成為日常生活的特色蔬菜之一。本文利用溶劑萃取法對(duì)白簕葉不同極性部位做初步分離，并對(duì)不同部位的成分及抗氧化功效進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)分離得到白簕葉的乙酸乙酯、正丁醇，及水提部位，對(duì)3個(gè)部位進(jìn)行顯色鑒定和聚酰胺薄層色譜鑒定結(jié)果表明，3個(gè)部位中所含成分種類(lèi)和含量均有不同，在成分種類(lèi)上有少許交叉。

對(duì)3個(gè)部位體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)部位均具有不同程度的體外抗氧化活性，且三者的鐵還原力和總抗氧化力均與濃度之間存在較好的相關(guān)性，有量效關(guān)系。正丁醇部位對(duì)DPPH·清除率在低濃度時(shí)具有量效關(guān)系，隨著濃度的逐漸升高，到達(dá)9mg/mL以上時(shí)，清除率不再增加。3個(gè)部位的體外抗氧化活性強(qiáng)弱依次為：正丁醇部位＞水提部位＞乙酸乙酯部位，說(shuō)明正丁醇部位具有體外抗氧化力的物質(zhì)活性較強(qiáng)或含量較高。VC是一種公認(rèn)的經(jīng)典抗氧化物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)中取VC進(jìn)行相比，發(fā)現(xiàn)正丁醇部位的總抗氧化力、鐵還原力以及對(duì)DPPH·清除率均明顯高于VC；而水提部位除DPPH·清除率與VC接近，其鐵還原力和總抗氧化力均高于VC。結(jié)果提示正丁醇部位和水提部位是白簕葉中抗氧化活性的主要部位，值得重點(diǎn)進(jìn)一步研究，可通過(guò)進(jìn)一步分離分析，確定白簕葉抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Research on Antioxidant Activity of Different Fractions of Acanthopanax trifoliatus Leaves in Vitro

YANG Hui-wen1，ZHANG Xu-hong1，CHEN Jian-mei1，PAN Yu-fang1，*，QIAN Jing2
（1.College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Department of Arts and Science，Yangzhou Polytechnic Institute，Yangzhou 225000，Jiangsu，China）

To study the antioxidant activity of different fractions from Acanthopanax trifoliatus leaves in vitro，the leaves were extracted and separated into three parts with different polarity.Three methods including 2，2-diphenyl-1-picrylhyd-razyl radical scavenging assay，ferric reducing power and total antioxidant power were performed to detect the antioxidant activity.The results showed that among the three fractions，n-butanol layer exhitbited the strongest antioxidant activitie comparing with ethyl acetate，and water layer.

Acanthopanax trifoliatus leaves；flavonoid；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.004

2013-12-28

楊慧文（1983—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事藥學(xué)及新藥開(kāi)發(fā)的研究

*通信作者：潘育方（1966—），男，教授，主要從事藥物新劑型及安全性評(píng)價(jià)的研究。