貝盞臨，張欣，雷茜，張安東

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021）

香水梨果實(shí)多酚氧化酶動力學(xué)研究及其底物對組織褐變的影響

貝盞臨，張欣，雷茜，張安東

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021）

以寧夏海原香水梨為試材，采用分光光度法對香水梨多酚氧化酶（PPO）及不同抑制劑的動力學(xué)特征及其底物對組織褐變的影響進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)表明：香水梨PPO活性是隨時間變化逐漸增加，正好與香水梨出現(xiàn)褐變的時間吻合；將鄰苯二酚和焦性沒食子酸兩種底物與香水梨PPO作用后進(jìn)行全波段（200 nm～650 nm）掃描，274、275 nm處有吸收峰，可推斷香水梨PPO作用鄰位二元酚和三元酚能力很強(qiáng)；以鄰苯二酚為底物，測定不同抑制劑對香水梨PPO活力的影響，抑制效果依次為抗壞血酸>間苯二酚>L-半胱氨酸>EDTA。

香水梨；多酚氧化酶；活性；底物專一性；抑制效應(yīng)

香水梨（Pgrus ussuriensismaxim），又名軟兒梨、化心梨、消梨、老香水，屬波斯梨科果實(shí)，是梨中獨(dú)一種。香水梨黃河沿岸普遍栽植，入秋成色清黃鮮亮，果味微酸，熟后摘下凍藏，肉質(zhì)變成褐色，解凍后汁液較多，營養(yǎng)豐富，食如甘蜜，可潤肺止咳、清胃瀉火，亦能醒酒，是饋贈親友的珍品。寧夏海原縣種植香水梨的歷史近百年，尤其是關(guān)橋鄉(xiāng)、史店鄉(xiāng)等地產(chǎn)出的香水梨色、香、味獨(dú)特，清涼爽口，深得區(qū)內(nèi)外各地客商的青睞，每到收獲季節(jié)，南來北往的商販紛至沓來。香水梨在寧夏海原地區(qū)種植面積廣，產(chǎn)量大，是鮮食和罐頭加工的主要品種之一，但由于褐變作用導(dǎo)致梨的顏色變深[1]，從而大大降低了產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用價值，是長期以來需要解決的一個問題。本實(shí)驗(yàn)研究了香水梨果實(shí)多酚氧化酶的作用條件以及抑制劑對該酶的抑制效果，可為提高香水梨加工、貯藏過程中的感官質(zhì)量，提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

香水梨于2012年9月底采自寧夏海原縣關(guān)橋鄉(xiāng)，經(jīng)過后熟軟化后置于-20℃冰箱凍藏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯二酚、焦性沒食子酸、間苯二酚、L-酪氨酸、乙二胺四乙酸、抗壞血酸，藥品均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

FA2104B電子天平、UV765紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；ALPHA 1-2冷凍干燥機(jī)：德國Marin Christ公司；Sigma4K15離心機(jī)：德國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚氧化酶的活性測定

取保存在冰箱的香水梨，去皮后稱取20 g果肉，加入10mL 0.1mol/LpH 6.0的冷磷酸緩沖溶液，用研缽研碎成漿，此過程不少于5min，用pH 6.0的冷磷酸緩沖溶液定容到100mL，4℃下浸提10min，4層紗布粗濾后立即在4℃下8 000 r/min離心10min，離心后取上清液，加入適量活性炭脫色30min，過濾即得PPO提取液[2-3]。香水梨多酚氧化酶提取液保存在冰箱內(nèi)。

比色皿中加入0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL，0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液至比色皿3/4處，PPO提取液0.5mL，混勻后在400mm處比色，在PPO提取液加入后開始計時，每30秒記錄一次OD隨時間的變化值，測3組值，以最初直線段的斜率（△D/t）計算酶活力。一個酶活力單位定義為：在測定條件下，以在1min內(nèi)引起吸光度增加0.01所需的量為一個酶活性單位（以U/min表示）[4-5]。

1.2.2 多酚氧化酶的底物專一性

以濃度均為0.01mol/L的多酚氧化酶發(fā)生反應(yīng)的底物，分別吸取1mL得鄰苯二酚和焦性沒食子酸在恒溫水浴鍋30℃下保溫10min，再分別吸取0.1mol/L pH6.0的磷酸緩沖溶5mL和PPO PPO提取液1mL，在恒溫水浴鍋30℃下反應(yīng)5min，用UV765紫外-可見分光光度計在200 nm～650 nm掃描[6]。

1.2.3 不同抑制劑對多酚氧化酶活性的影響

以鄰苯二酚作底物，測定EDTA、VC、L-半胱氨酸、間苯二酚等4種抑制劑對多酚氧化酶活力的影響[7]。抑制劑與酶不同預(yù)結(jié)合時間（0～20min）對酶活性的影響，并采用分光光度法測定酶活[8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚氧化酶的活性測定結(jié)果分析

香水梨PPO活性隨時間的變化見圖1。

圖1 香水梨PPO活力隨時間變化曲線Fig.1 Pgrus ussuriensismaxim PPO activity changes with time

香水梨多酚氧化酶活性是隨時間變化逐漸有上升的趨勢，最終趨于平緩。多酚氧化酶活性的顯著增加正好與香水梨出現(xiàn)褐變的時間相吻合。

2.2 多酚氧化酶與底物作用結(jié)果

多酚氧化酶與底物作用結(jié)果見圖2。

圖2 香水梨PPO氧化兩種底物所產(chǎn)生的吸收曲線Fig.2 Absorption curve of Pgrus ussuriensismaxim PPO oxidation of two kinds of substrate generated

將香水梨多酚氧化酶與鄰苯二酚、焦性沒食子酸兩種底物作用后的產(chǎn)物在200 nm～650 nm進(jìn)行掃描，觀察到以鄰苯二酚、焦性沒食子酸反應(yīng)均有吸收峰出現(xiàn)，分別是274、275 nm。

2.3 不同抑制劑對多酚氧化酶活性的影響

不同抑制劑對多酚氧化酶活性的影響如圖3。

圖3 不同抑制劑對香水梨PPO活性的影響Fig.3 Effects of different inhibitors on PPO activity of Pgrus ussuriensismaxim

多酚氧化酶活性是酶促褐變的關(guān)鍵制約因素之一[10-11]，EDTA對香水梨中多酚氧化酶的抑制作用不是十分理想，L-半胱氨酸、間苯二酚、抗壞血酸，較EDTA能較好地抑制多酚氧化酶的活性。在同一濃度下，不同抑制劑對多酚氧化酶的抑制效果存在差異，其中抗壞血酸抑制香水梨中多酚氧化酶的活性的效果為最好，其次才是是間苯二酚、L-半胱氨酸、EDTA。

3 結(jié)論與討論

香水梨采后貯藏初期，酚類物質(zhì)主要是合成過程，香水梨貯藏酚類物質(zhì)減少是由于多酚氧化酶催化下而被氧化成黑色物質(zhì)導(dǎo)致褐變所致，說明香水梨的褐變是以酚類物質(zhì)為作用底物的多酚氧化酶所引起的酶促氧化褐變。

此外，香水梨多酚氧化酶作用鄰位二元酚和三元酚能力很強(qiáng)，通常多元酚不能使苯環(huán)上引入了某些基團(tuán)激活苯環(huán)，才會出現(xiàn)吸收峰。同一濃度下，抑制香水梨中多酚氧化酶的活性的效果為抗壞血酸>間苯二酚>L-半胱氨酸>EDTA。對于香水梨多酚氧化酶的抑制劑在實(shí)際生產(chǎn)中較為理想的是抗壞血酸，它既具有較好的抑制效果，又是食品中固有的營養(yǎng)成分，且安全性高。但是抗壞血酸本身易于被氧化，所以要使其能保持一定的抑制效果就要保持其含量的穩(wěn)定。在果品加工過程中提倡多種抑制劑結(jié)合使用以提高抗褐變效果，因此還需在對香水梨抑制劑單因素研究的基礎(chǔ)上，對不同抑制劑多因素協(xié)同作用機(jī)理和抑制效應(yīng)做深入綜合研究，更好地提高對香水梨多酚氧化酶的活性的抑制效果。

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Effect of Pgrus ussuriensismaxim Polyphenol Oxidase Kinetics and Substrate on Fruit Browning

BEI Zhan-lin，ZHANG Xin，LEI Qian，ZHANG An-dong
（College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

In this experiment，Ningxia Haiyuan Pgrus ussuriensis maxim as material，using spectrophotometry to Pgrus ussuriensismaxim polyphenol oxidase （PPO）and different inhibitors and substrates on the dynamic characteristics of Tissue Browning were studied.Experiments showed that Pgrus ussuriensis maxim PPO activity was gradually increased with time change，just browning time consistent with Pgrus ussuriensis maxim appear；the catechol and pyrogallol two substrates and Pgrus ussuriensismaxim after PPO of full band（200 nm-650 nm）scanning，274 nm，275 nm of a peak，Can be inferred Pgrus ussuriensismaxim PPO ortho phenol and three yuan two yuan strong ability to phenol；Catechol as substrate，to determine the effects of different inhibitors on the activity of PPO inhibitory effect of Pgrus ussuriensismaxim，followed by VC>L-cysteine>resorcinol>EDTA.

Pgrus ussuriensismaxim；polyphenol oxidase；activity；substrate specificity；inhibitory effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.001

2013-12-16

寧夏科技支撐項(xiàng)目（2012）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（XJCX-2014-102）

貝盞臨（1975—），男（漢），講師，碩士，主要從事植物資源與利用的科研和教學(xué)工作。