孟立平，蔣承建，趙飛，郭艷，池菊芳，郭航遠

（1.紹興市人民醫(yī)院 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，浙江 杭州 310000）

·技術(shù)與方法·

大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞原代培養(yǎng)方法的改進

孟立平1，2，蔣承建1，趙飛1，2，郭艷3，池菊芳1，郭航遠1，2

（1.紹興市人民醫(yī)院 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，浙江 杭州 310000）

目的：探索提高大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）原代培養(yǎng)效率和純度的方法。方法：在原有組織貼塊法培育大鼠原代VSMCs的基礎(chǔ)上進行改良，分離出胸主動脈后進一步分離中膜，DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10 μg/L血小板源性生長因子B（PDGF-B）。用細胞形態(tài)學(xué)及細胞免疫熒光對VSMCs進行鑒定。結(jié)果：6 d左右組織塊周圍有細胞爬出，12 d左右可以傳代。鏡下見細胞呈梭形，典型“峰谷”狀排列生長；免疫熒光鑒定可見大量平滑肌肌動蛋白（SMA），比傳統(tǒng)方法獲得的細胞純度高。結(jié)論：加入PDGF-B可以縮短大鼠VSMCs原代培養(yǎng)時間，提高效率；剝離中膜可以提高大鼠VSMCs原代細胞的純度。

原代細胞；血管平滑肌細胞；組織貼塊法；血小板源性生長因子B

血管成形術(shù)和支架植入術(shù)是治療嚴(yán)重冠狀動脈粥樣硬化的主要方法，術(shù)后發(fā)生血管再狹窄是心血管醫(yī)師面臨的一個棘手的問題[1]。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和遷移以及從已經(jīng)分化的收縮型表型向未分化的分泌型表型轉(zhuǎn)化造成大量的細胞外基質(zhì)分泌[2-4]，在術(shù)后再狹窄發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用。體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌原代細胞，是研究VSMCs增殖遷移以及細胞表型轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。目前大鼠胸主動脈VSMCs的培養(yǎng)方法主要包括酶消化法[5]和組織貼塊法[6-7]。由于酶消化法成本較高，獲得的細胞活性較貼塊法差，所以國內(nèi)一般采用組織貼塊法來培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs。但組織貼塊法獲得VSMCs存在周期長、純度低等缺點。因此，筆者對組織貼塊法大鼠主動脈VSMCs原代培養(yǎng)方法進行了部分改良，縮短了培養(yǎng)周期，獲得了純度高、活性好的VSMCs。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠，雌雄不限，50 d左右，體質(zhì)量150～180 g（購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心）。

1.1.2 實驗試劑：乙醚（杭州化學(xué)試劑有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉索（GIBCO公司），抗大鼠平滑肌肌動蛋白（SM-actin，SMA）單克隆抗體（ABCOM公司），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Jackson公司），血小板源性生長因子B（platelet derived growth factor，PDGF-B，R&D公司）。

1.1.3 實驗儀器和設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司），低速離心機（合肥科大創(chuàng)新中佳公司），組織剪、止血鉗（上海醫(yī)療器械集團有限公司手術(shù)器械廠），眼科剪、眼科鑷（蘇州六六視覺科技股份有限公司），顯微剪、顯微鑷（寧波成和顯微器械廠），25 cm細胞培養(yǎng)瓶（康寧公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠胸主動脈VSMCs原代培養(yǎng)：用乙醚將大鼠麻醉后，將除大鼠頭部以外的部分全部置于75%乙醇浸泡3 min消毒。在無菌動物操作臺上，打開大鼠胸腔，翻開肺之后即可見胸主動脈，用眼科鑷小心分離胸主動脈，剪下后放入盛有DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入細胞操作室，在體式顯微鏡下，用顯微鑷快速去除血管周圍大塊的脂肪組織，用顯微剪剪開血管，去除血凝塊后將剪開的動脈轉(zhuǎn)入另一干凈的盛有DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用眼科彎鑷輕輕刮除動脈內(nèi)膜，去除內(nèi)皮細胞。然后剪開的動脈內(nèi)膜面朝上，準(zhǔn)備兩把眼科彎鑷，一把按壓固定血管，一把壓住動脈后往相反方向推，中膜會出現(xiàn)破口，隨后中膜和外膜之間由于組織結(jié)構(gòu)的不同而分離開來。刮取下來的中膜因富含VSMCs而保持了血管形態(tài)，而外膜在失去中膜的支撐之后失去原有的血管結(jié)構(gòu)。將分離下來的中膜移到培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)面，轉(zhuǎn)入超凈工作臺。用眼科剪剪碎血管中膜，用長滴管頭部黏住剪碎了的組織塊，小心轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶，均勻貼壁，組織塊間距大約為5 mm。直立細胞培養(yǎng)瓶，加入5 mL含有20%胎牛血清以及10 μg/L PDGF-B的DMEM高糖培養(yǎng)液，蓋緊瓶蓋，細胞瓶倒置放于細胞培養(yǎng)箱中約3 h，使組織塊牢固貼壁，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液覆蓋組織塊。靜置4～6 d，換液1次，6 d左右可見細胞爬出，10～14 d組織塊周圍的細胞出現(xiàn)融合，可以消化傳代。

1.2.2 大鼠胸主動脈血管平滑肌原代細胞的鑒定：①形態(tài)學(xué)鑒定：常規(guī)倒置相差顯微鏡下觀察VSMCs的形狀、排列以及生長特點。②細胞免疫熒光：將第2代細胞接種于96孔板，每孔3 000～5 000個細胞，培養(yǎng)1～2 d待細胞開始融合前，PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，PBS清洗3遍后再用0.25% TritonX 100穿破細胞膜，PBS清洗3遍，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋250倍的抗SMA抗體，4 ℃過夜，PBST清洗3遍之后加入結(jié)合有FITC的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后PBS清洗3遍，再用1 μg/mL DAPI染核，PBS清洗。用熒光顯微鏡拍攝同一界面的綠色熒光圖和藍色核染圖，經(jīng)Image pro plus 6.0將同一部位的兩張照片疊加，判斷VSMCs純度。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 大鼠胸主動脈VSMCs原代培養(yǎng)時6 d左右組織塊周圍有細胞爬出，細胞形態(tài)多樣，呈梭形、星形、卵圓形、不規(guī)則型（見圖1A）。12 d左右組織塊周圍的細胞明顯融合，可以進行傳代（見圖1B）。傳代之后細胞形態(tài)區(qū)域一致成梭形條狀，并出現(xiàn)典型的“峰谷”現(xiàn)象（見圖1C）。

圖1 大鼠胸主動脈VSMCs原代培養(yǎng)（×100）

2.2 細胞免疫熒光鑒定 經(jīng)抗SMA定位細胞肌動蛋白，結(jié)合有FICT熒光的二抗在激發(fā)顯影后可在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出綠色熒光，細胞核不著色（見圖2A）。DAPI染核之后，細胞核在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出藍色熒光，細胞質(zhì)不著色（見圖2B）。用Image pro plus 6.0將同一部位的DAPI核染與FICT熒光照片合成之后，可見細胞核和SMA之間的關(guān)系。用傳統(tǒng)的不剝離主動脈中膜的方法，有些細胞核的周圍并沒有FICT綠色熒光顯影（見圖2C），而用本實驗中改良了的剝離中膜培養(yǎng)VSMCs的方法獲得的VSMCs，基本是核與SMA綠色熒光一一對應(yīng)（見圖2D）。

3 討論

PDGF是一種重要的促有絲分裂因子，能夠刺激膠原酶的活化和膠原的合成，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的更新，并促進DNA合成和細胞裂解，最終促進VSMCs分裂增生[8-9]。雖然有國外研究顯示鋪入細胞瓶中的大鼠主動脈中膜組織塊周圍也可以檢測到有PDGF等生長因子的分泌，但是其濃度很低，而且在組織塊周圍的濃度分布不均勻[10]。本實驗用原先沒有加入PDGF-B的原代培養(yǎng)方法，組織塊周圍一般要8 d左右才有細胞爬出，2周左右細胞開始融合，而用加入10 μg/L PDGF-B的原代培養(yǎng)改良方法，約6 d組織塊周圍就有細胞爬出，10 d左右出現(xiàn)細胞融合，可以有效縮短原代培養(yǎng)的時間，提高實驗效率。

大鼠胸主動脈組織結(jié)構(gòu)分為三層，分別為內(nèi)膜、中膜和外膜。內(nèi)膜很薄，主要由內(nèi)皮細胞構(gòu)成，由于內(nèi)皮細胞相對比較脆弱，取出大鼠胸主動脈剪開血管后，用彎鑷輕輕刮過內(nèi)膜，即可將內(nèi)皮細胞去除；中膜較厚，主要由VSMCs組成，是血管收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；外膜的厚度與中膜相當(dāng)，主要由疏松結(jié)締組織組成。外膜和中膜之間有外彈性膜相隔。傳統(tǒng)的大鼠主動脈血管平滑肌原代培養(yǎng)方法在刮去內(nèi)膜之后直接剪碎血管鋪入培養(yǎng)瓶中，沒有將中膜和外膜分離開，造成外膜中成纖維細胞跟中膜中的平滑肌細胞一起培養(yǎng)出來（如圖2C所示）。雖然國內(nèi)有文獻報道稱這些成纖維細胞在幾次傳代之后會自然消失，可以通過傳代的方法達到純化平滑肌細胞的目的[11]，但是據(jù)Sartore等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞在外部環(huán)境發(fā)生改變時會轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞，跟平滑肌細胞一樣可以表達SMA，造成平滑肌細胞鑒定時的假陽性結(jié)果。所以在原代細胞培養(yǎng)時，為了獲取高純度的VSMCs，將中膜與外膜分離開是完全有必要的。筆者通過反復(fù)實驗摸索發(fā)現(xiàn)用鑷子牽拉、撕扯、分離中膜的方法會大大損傷組織塊的活性，以致鋪瓶之后的組織塊活性降低或者消失，延長原代細胞爬出時間甚至培養(yǎng)失敗。結(jié)合大鼠胸主動脈結(jié)構(gòu)的組織基礎(chǔ)，本實驗室在剪開胸主動脈去除血凝塊刮去內(nèi)膜之后，采用兩把眼科彎鑷，一把按壓固定血管，一把向相反方向鈍性加壓，中膜在出現(xiàn)破口之后開始與外膜分離。用此方法既可以剝離下來完整的保留血管結(jié)構(gòu)的中膜，又大大減少了剝離過程中對中膜的牽拉損傷，最大程度上保護了中膜的活性，提高原代VSMCs的純度。

另外由于幼年SD大鼠的VSMCs分裂增殖相對活躍，結(jié)合幼鼠操作上的難易程度，實驗一般選用6周齡左右的SD大鼠。為了更好地保持取出的主動脈血管活性，操作時采用預(yù)冷的DMEM高糖培養(yǎng)液。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，邊緣整齊的組織塊相比于邊緣粗糙的組織塊周圍更容易長出VSMCs，可能是因為在剪碎血管中膜時邊緣整齊的組織塊所受到的破壞較小，所以選用鋒利的眼科剪來剪碎血管中膜有利于原代平滑肌細胞的培養(yǎng)。在組織塊貼塊培養(yǎng)時，組織塊周圍會分泌一些PDGF、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等有利于原代細胞爬出的細胞生長因子[8]，頻繁地移動觀看細胞生長情況會降低組織塊周圍的細胞生長因子濃度，導(dǎo)致原代細胞培養(yǎng)時間延長甚至培養(yǎng)失敗，一般4 d左右換液1次即可。

綜上所述，在原有用組織塊法培養(yǎng)原代大鼠胸主動脈VSMCs的基礎(chǔ)上，通過在培養(yǎng)液中加入10 μg/L PDGF-B，可以縮短原代的培養(yǎng)時間，提高效率；通過彎鑷加壓分離血管中膜，可以提高原代VSMCs的純度。

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（本文編輯：丁敏嬌）

An improvement in primary culture of rat vascular smooth muscle cells and its identification

MENG Liping1,2, JIANG Chengjian1, ZHAO Fei1,2, GUO Yan3, CHI Jufang1, GUO Hangyuan1,2. 1.Department of Cardiology, Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing Hospital of Zhejiang University, Shaoxing, 312000; 2.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310000

Objective: To explore a new effective way on primary culture of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs), which could shorten the cultivate time and enhance the VSMCs’ purity. Methods: The primary culture of rat VSMCs was conducted by a new way reformed from the traditional modified tissue explant technique, in which the medial layer was isolated and 10 μg/L PDGF-B was added to the high glucose DMEM. The VSMCs were identified by cell morphology and immunocytochemistry. Results: About six day later, VSMCs could be found around some tissue blocks, and passage of the VSMCs can be done about 12 days later. Under the phase contrast microscope, the VSMCs looks like spindle and the specific “hill and valley” phenomenon could be seen. Immunocytochemistry showed that there was a large number of smooth muscle actin (SMA) and the VSMCs’ purity was much higher than the cells got by the old way. Conclusion: Adding PDGF-B could shorten the cultivate time of primary VSMCs and isolation of the medial layer could improve the VSMCs’purity.

primary cells; VSMCs; tissue explant technique; PDGF-B

R331

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.011

2014-12-15

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY14H020002）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程資助項目（CXRC201201）；浙江省公益技術(shù)研究社會發(fā)展項目（2012C33040）；紹興市科技局科研基金資助項目（2013B70072）。

孟立平（1989-），男，浙江紹興人，碩士生。

郭航遠，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：ghangyuan @hotmail.com。