黃凌霄，潘瓊慧，鄭建瓊，朱雪燕，朱雪瓊

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

HPV E6/E7 mRNA在CIN II及以上病變中的診斷價值

黃凌霄1，潘瓊慧1，鄭建瓊1，朱雪燕1，朱雪瓊2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

目的：探討人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA檢測在CIN II及以上宮頸病變（CIN II+）診斷中的應(yīng)用價值。方法：2014年1月至9月在溫州市人民醫(yī)院婦科門診行宮頸篩查發(fā)現(xiàn)新柏超薄液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）≥未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）和/或高危HPV DNA陽性的患者426例，其中TCT結(jié)果為ASCUS者156例，均行宮頸HPV E6/E7 mRNA檢測和組織病理學(xué)檢查。根據(jù)病理結(jié)果將病例分為5組，分析HPV E6/ E7 mRNA拷貝數(shù)與病變程度的相關(guān)性。利用受試者工作特征（ROC）曲線評價HPV E6/E7 mRNA對ASCUS患者CIN II+的預(yù)測價值。結(jié)果：宮頸癌組HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)最高，慢性子宮頸炎組拷貝數(shù)最低。Spearman等級相關(guān)分析顯示組織學(xué)病變程度與HPV E6/E7 mRNA水平與之間存在正相關(guān)性（r=0.549，P＜0.001)。在CIN II+中，HPV E6/E7 mRNA陽性率為91.6%，HR-HPV DNA陽性率為93.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=0.197，P＞0.05）。ROC曲線顯示，HPV E6/E7 mRNA預(yù)測CIN II+最佳臨界值為147.965。HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA檢測預(yù)測ASCUS患者CIN II+的靈敏度、陰性預(yù)測值相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩者特異度、陽性預(yù)測值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：隨著宮頸病變程度增加，HPV E6/ E7 mRNA拷貝數(shù)相應(yīng)增加。與HPV DNA檢測方法相比，HPV E6/E7 mRNA檢測對ASCUS患者CIN II+的特異度、陽性預(yù)測值更高，可作為ASCUS患者分流管理的有效措施。

E6/E7 mRNA；人乳頭瘤病毒；DNA；宮頸病變

高危型人乳頭瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HR-HPV）持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌發(fā)生的主要病因，特別是HPV癌基因E6/E7的表達(dá)對于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)歸和維持起著重要作用，但由于E6/E7感染宿主的環(huán)境因素的差異，感染的自然進(jìn)展在不同人群間存在著差異，在不同病變級別的宮頸組織中也存在著差異。本研究采用支鏈DNA信號放大技術(shù)（branched DNA，bDNA）檢測HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變中的表達(dá)水平，探討各級別間HPV E6/E7 mRNA拷貝情況，評估其在CIN II及以上宮頸病變早期診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2014年1月至9月因新柏超薄液基細(xì)胞學(xué)檢查（thin-prep cytology test，TCT）≥未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squa

mous cells of undermined significance，ASCUS）和/或HR-HPV DNA陽性的患者426例，均行HPV E6/ E7 mRNA檢查及陰道鏡下宮頸活檢，其中TCT結(jié)果為ASCUS 156例。426例患者年齡24～76歲，均無CIN史、盆腔放射治療史、子宮切除史，排除妊娠，取材前3 d內(nèi)無性生活史。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢查：宮頸刷插入宮頸外口旋轉(zhuǎn)5周，采集宮頸表面及宮頸管內(nèi)脫落細(xì)胞，將細(xì)胞洗脫在新柏氏膜式液基液中，用TCT專用制片機制成薄層涂片，經(jīng)巴氏染色后鏡檢。宮頸細(xì)胞學(xué)診斷按照國際癌癥協(xié)會推薦的TBS分類法，具體分為未見上皮內(nèi)瘤變或惡性細(xì)胞（negative for intraepithelial lesion and malignancy，NILM）、ASCUS、不排除高度鱗狀上皮病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells cannot exclude HSIL，ASC-H）、低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（high-squamous intraepithelial lesion，HSIL）及鱗癌（squamous cell cancer，SCC）。

1.2.2 HPV DNA檢測：用HPV專用毛刷取材，將鱗柱上皮交界處和宮頸管采集的細(xì)胞洗脫在HPV專用取樣瓶中。采用PCR反向點雜交技術(shù)進(jìn)行分型。共分23種亞型，低危型5種，包括HPV 11、42、43、6、81；高危型18種，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83。1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測：采用bDNA法檢測脫落細(xì)胞中14種HR-HPV E6/E7 mRNA水平，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。試劑盒購自河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。標(biāo)本采用冷光儀檢測，檢測結(jié)果為光子數(shù)，經(jīng)計算軟件轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，拷貝數(shù)＞0 copy/mL為陽性。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查：TCT≥ASCUS和/或HR-HPV DNA陽性的患者行陰道鏡下宮頸活檢。病理學(xué)診斷分為：慢性子宮頸炎、CINI、CIN II、CIN III、宮頸癌，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》[1]。對病理檢查結(jié)果≥CIN II的患者行宮頸環(huán)形電切術(shù)或?qū)m頸錐切術(shù)，以獲取進(jìn)一步病理診斷。若不同部位有不同級別診斷，以病理級別最高者作為最后診斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 對5組不同宮頸病變的HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)進(jìn)行探索性研究，結(jié)果用箱線圖表示。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)比較采用Mann-Whitney檢驗。率的比較采用x2檢驗或Fisher精確概率檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。診斷價值采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理檢查結(jié)果與HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)比較由圖1可見，5組不同級別宮頸病變的HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)均呈偏態(tài)分布，隨著病變級別增高，HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)有增高趨勢。對各組HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)進(jìn)行分析（見表1），宮頸癌組HPV E6/ E7 mRNA拷貝數(shù)最高，慢性子宮頸炎組最低，CIN II與CIN III組拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。將宮頸組織病理結(jié)果與HPV E6/E7 mRNA水平進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析，兩者相關(guān)系數(shù)r=0.549（P＜0.001），提示HPV E6/E7 mRNA水平與組織學(xué)病變程度之間存在正相關(guān)性。

圖1 組織學(xué)不同級別病變HPV E6/E7 mRNA水平的箱線圖

表1 組織學(xué)不同級別病變HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)比較（copy/ mL）

2.2 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA及病理檢查結(jié)果由表2可見，各組間HPV E6/E7 mRNA陽性率有差異。CIN II+組（CIN II、CIN III、宮頸癌）HPV E6/E7 mRNA陽性率顯著高于慢性子宮頸炎和CINI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。HPV E6/E7 mRNA和HRHPV DNA檢測相比較，兩者對于CIN II+的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA表達(dá)與宮頸病變之間關(guān)系n（%）

2.3 HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA對ASCUS患者CIN II+的診斷 接受宮頸活檢的426例患者中TCT結(jié)果為ASCUS者156例。由圖2可見，HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA診斷ASCUS患者CIN II及以上宮頸病變的ROC曲線下面積分別為0.800（95%CI：0.727～0.873）、0.563（95%CI：0.470～0.657）。HPV E6/E7 mRNA檢測的臨界值為147.965，以HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)≥147.965為預(yù)測界值，其預(yù)測CIN II+的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為90.0%、64.2%、54.2%、93.2%。HR-HPV DNA陽性預(yù)測CIN II+的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為94.0%、22.6%、36.4%、88.9%。兩方法預(yù)測CIN II+的靈敏度、陰性預(yù)測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但HPV E6/E7 mRNA預(yù)測CIN II+的特異度、陽性預(yù)測值均高于HR-HPV DNA檢測（P＜0.05），見表3。

圖2 HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA預(yù)測ASCUS患者CIN II+的ROC曲線

表3 ASCUS患者HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA表達(dá)與宮頸病變之間關(guān)系（例）

3 討論

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險因素。幾乎100%的高級別CIN以及宮頸癌都合并HPV感染[2]。其發(fā)生的分子機制是病毒DNA將以E6/E7為主的基因片段整合到宿主細(xì)胞的DNA中，通過激活調(diào)節(jié)病毒生長的E6/E7基因片段，致E6/E7癌基因蛋白的持續(xù)性高表達(dá)，使宿主細(xì)胞性質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而向?qū)m頸高度病變進(jìn)展[3]。因此HPV E6/E7表達(dá)上調(diào)是宮頸細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)變所必需的。

HPV DNA檢測現(xiàn)廣泛用于宮頸病變的篩查和隨訪，尤其是在ASCUS患者的分流中有重要作用。ASCUS的診斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞出現(xiàn)比單純反應(yīng)性改變更加顯著的異常特征，但未達(dá)到診斷鱗狀上皮內(nèi)病變的程度，其可能提示慢性子宮頸炎、CIN，甚至是宮頸癌[4-5]。故應(yīng)十分重視和加強對ASCUS患者及時、有效地評價和管理，防止宮頸浸潤癌的發(fā)生。2012年美國陰道鏡和病理學(xué)會（American Society of Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）提出對于ASCUS的最佳方案為反饋性HPV檢測，陽性者行陰道鏡檢查[6]。但HPV DNA檢測不能區(qū)分宮頸退行性HPV感染、持續(xù)性HPV感染及進(jìn)行性發(fā)展的HPV感染，且HPV DNA在凋亡細(xì)胞及細(xì)胞碎屑中也可表達(dá)，這導(dǎo)致HPV DNA陽性結(jié)果不能準(zhǔn)確說明致癌風(fēng)險，反而增加患者對宮頸癌的精神心理負(fù)擔(dān)，甚至出現(xiàn)過度治療[7-8]。因此需采取更好的方法對ASCUS患者的HPV感染進(jìn)行檢測，進(jìn)一步篩選出高級別宮頸病變甚至是宮頸癌。

本研究發(fā)現(xiàn)，CIN II+（CIN II、CIN III、宮頸癌）組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于CINI-（慢性子宮頸炎、CINI）組，且不同等級宮頸病變的HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)不同，慢性子宮頸炎組拷貝數(shù)最低，宮頸癌組拷貝數(shù)最高，HPV E6/E7 mRNA水平與組織學(xué)病變程度之間存在正相關(guān)性。因此在宮頸篩查過程中，HPV E6/E7 mRNA水平越高，更需警惕宮頸病變甚至是宮頸癌的可能。而HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA檢測相比，對CIN II+的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在兩種檢測結(jié)果均陽性的情況下，HPV E6/E7 mRNA拷貝水平就在宮頸病變嚴(yán)重程度的評估和處理方法的指導(dǎo)上具有更重要的意義。

本研究比較HPV E6/E7 mRNA及HR-HPV DNA檢測對ASCUS患者CIN II+的預(yù)測價值，通過ROC曲線分析，HPV E6/E7 mRNA的最佳臨界點為147.965，以最佳臨界點為篩選標(biāo)準(zhǔn)時，HPV E6/E7 mRNA預(yù)測ASCUS患者CIN II+的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為90.0%、64.2%、54.2%、93.2%。與HR-HPV DNA檢測相比，其特異度和陽性預(yù)測值均較高，靈敏度、陰性預(yù)測值相近。與本研究結(jié)果不同，Benevolo等[9]報道，對于ASCUS患者HPV E6/ E7 mRNA檢測預(yù)測CIN II+的靈敏度低于HR-HPV DNA檢測。目前用于檢測HPV E6/E7 mRNA水平的方法有核酸序列擴增法（如PCR、NASBA、TMA）和支鏈DNA信號放大技術(shù)，部分市售的試劑僅檢測HR-HPV l6、18、31、33、45中E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄[10]，而本研究所用試劑可檢測14種HR-HPV mRNA，故敏感性更高，與HR-HPV DNA檢測相比，在有更高特異性的前提下，不降低敏感度。

本研究中有2例HR-HPV DNA陰性，但HPV E6/E7 mRNA陽性者行宮頸活檢，病理報告為CIN III。Cattani等[11]使用多聚合PCR對HR-HPV DNA陰性、HPV E6/ E7 mRNA陽性的病例進(jìn)行復(fù)查，可以檢測到病毒基因組E6區(qū)域的DNA，證明這些病例中仍存在非常低的病毒拷貝。可能是由于特殊的HPV DNA片段整合到宿主基因，整合后的L1基因缺失影響病毒復(fù)制，導(dǎo)致低病毒載量，但整合后的惡性表型卻能使E6/ E7癌基因持續(xù)過表達(dá)。因此，RNA比DNA分析能檢測出更多臨床上的顯著感染。2012版ASCCP的宮頸篩查指南提出，ASCUS患者合并HPV陰性時，可暫緩陰道鏡檢查，根據(jù)該處理原則可能會造成部分高級別宮頸病變的漏診。另外，指南將21～24歲婦女列為特殊人群，認(rèn)為在該年齡段ASCUS患者的處理中，HPV DNA檢測并非最佳方案，即使結(jié)果陽性，仍不建議直接行陰道鏡檢查。本研究中有1例24歲的HPV 16型陽性ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)達(dá)31 254.57，經(jīng)患者知情同意后行陰道鏡下宮頸活檢，病理診斷為CIN II。雖然30歲以下尤其是25歲以下的年輕女性，子宮頸癌的發(fā)生率非常低，但隨訪過程中仍然有可能遺漏高級別宮頸病變。故TCT提示ASCUS的患者，可同時行HPV E6/E7 mRNA檢測，以及時篩選出高級別宮頸病變，預(yù)防宮頸浸潤癌的發(fā)生。

目前，國內(nèi)宮頸篩查主要采用TCT聯(lián)合HPV DNA檢測。但HPV DNA檢測對于＜30歲婦女的檢測意義不大，因該年齡段婦女常合并HPV感染能自動清除。本研究慢性子宮頸炎患者中有部分病例HR-HPV DNA陽性但未檢測到HPV E6/E7 mRNA，這與HPV一過性感染的自然進(jìn)程相符合。另有6例HR-HPV DNA陽性的CINI、CIN II患者HPV E6/E7 mRNA為陰性，有文獻(xiàn)報道大部分CINI可自行逆轉(zhuǎn)，甚至32%的CINI也可自行消退[12]，所以HPV E6/E7 mRNA陰性可能預(yù)示著疾病的逆轉(zhuǎn)，但這部分病例仍需嚴(yán)密隨訪。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測不僅對ASCUS患者高級別病變具有較高的辨別能力，能更好地篩選出高危人群，為臨床醫(yī)生提供比DNA檢測更具有預(yù)測價值的檢測結(jié)果，而且排除可疑或低度病變的能力更強。在宮頸篩查中，尤其是對ASCUS患者行HPV E6/E7 mRNA檢測，能有效減少漏診，也避免了過度檢查、治療給患者帶來的痛苦和精神負(fù)擔(dān)。而HPV E6/E7 mRNA在30歲以下婦女中的應(yīng)用價值，仍需要大樣本研究來證實。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The diagnostic value of human papilloma virus E6/E7 mRNA detection in CINII+

HUANG Lingxiao1, PAN Qionghui1, ZHENG Jianqiong1, ZHU Xueyan1, ZHU Xueqiong2. 1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Clinical College of Wenzhou Medical University, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To evaluate the application value of detecting human papilloma virus (HPV) E6/E7 mRNA as a diagnose test for CINII+. Methods: From January to October in 2014, a total of 426 gynecological outpatients, whose TCT≥ASCUS or/and high-risk HPV DNA positive, were found by cervical lesions screening in Wenzhou People’s Hospital. All those outpatients performed HPV E6/E7 mRNA detection and histopathological examination. According to different histological results, samples were divided into 5 groups, the correlation between the expression of HPV E6/E7 mRNA and the severity of cervical lesions were analyzed. The ROC curve was used to assess the predictive value of HPV E6/E7 mRNA for CINII+ of ASCUS. Results: The cervical cancer group had the highest level of HPV E6/E7 mRNA while the chronic cervical inflammation group had the lowest. Spearman rank analysis demonstrated that the severity of cervical lesions was proportional to the expression of HPV E6/E7 mRNA (r=0.549, P＜0.001). For CINII+, there was no significant difference between HPV E6/ E7 mRNA and high-risk HPV DNA in positive rate (x2=0.197, P＞0.05). The ROC curve showed that HPV E6/ E7 mRNA＞147.965 were superior to any other standards to scan CINII+. The sensitivity and negative predictive value of HPV E6/E7 mRNA and HR-HPV DNA in predicting CINII+ of patients with ASCUS showed no statistically significant difference (P＞0.05), while the specificity and positive predictive value showed statistically significant difference (P＜0.05). Conclusion: The copy number of HPV E6/E7 mRNA transcripts is correlated with severe degree of epithelial cervical dysplasia. The specificity and positive predictive value of HPV E6/E7 mRNAdetection are higher than those of HPV DNA for diagnosis of CINII+ in patients with ASCUS, therefore HPV E6/ E7 mRNA detection may be a valuable tool for triage and patient follow-up.

E6/E7 mRNA; human papilloma virus; DNA; cervical lesions

R711.74

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.009

2015-02-01

黃凌霄（1984-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，在職碩士生。

朱雪瓊，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，Email：zjwzzxq@163.com。