鄭亦靜，張小磊，林焱，武垚森，張瓊

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

雙抗體靶向阿霉素納米藥物的研制及其靶向抗骨肉瘤作用

鄭亦靜，張小磊，林焱，武垚森，張瓊

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027）

目的：合成雙抗體（抗殼聚糖抗體、抗HER2抗體）-阿霉素-殼聚糖納米粒，研究其體外腫瘤細胞攝取實驗及骨肉瘤裸鼠體內(nèi)的靶向特性。方法：采用殼聚糖衍生物乙二醇殼聚糖制備雙抗體-阿霉素-殼聚糖（Abc-GC-Dox）納米粒、阿霉素-殼聚糖納米粒。在體外將藥物作用于HER2+裸鼠骨肉瘤細胞系MG-63細胞，研究體外腫瘤細胞攝取實驗，并采用免疫熒光的方法對其進行研究；14只骨肉瘤裸鼠隨機分為2組，尾靜脈注射不同藥物，觀察裸鼠體內(nèi)皮下骨肉瘤的靶向分布差異。結果：本實驗制得了穩(wěn)定的雙抗體靶向阿霉素納米粒，包封率為89．73%，載藥量為9.96%。通過體內(nèi)外實驗，雙抗體納米靶向藥物的靶向聚集濃度明顯高于無抗體納米藥物，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：本實驗成功制備了雙抗體靶向阿霉素納米藥物（Abc-GC-Dox），并證明該雙抗體納米粒提高了抗腫瘤藥物在骨肉瘤細胞內(nèi)的靶向分布，明顯提高了藥物濃度，并降低了藥物的不良反應，為臨床治療骨肉瘤提供了一種新的治療方法。

雙抗體聯(lián)合；阿霉素；乙二醇殼聚糖；納米粒；靶向治療；骨肉瘤；裸鼠

近年來，靶向納米藥物治療已成為腫瘤靶向治療研究的熱點，從20世紀80年代以來，相繼出現(xiàn)了生物靶向納米藥物[1]和理化靶向納米藥物[2]，如抗體靶向納米藥物、磁性靶向納米藥物等，并在臨床上取得了良好的治療效果[3]。阿霉素（doxorubicin）是一種廣譜抗腫瘤抗生素，可抑制腫瘤DNA、RNA和蛋白的合成，對細胞進行殺滅[4]。其抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬細胞周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用，是治療骨肉瘤的前沿藥物。殼聚糖（chitosan）具有良好的生物相容性和生物可降解性[5]，近年來逐漸出現(xiàn)在生物醫(yī)學工程以及藥物[6]、基因載體[7]等領域，是良好的納米載體。HER2蛋白在正常細胞中呈低表達或不表達，但在各類腫瘤細胞中呈高表達，尤其在骨肉瘤中表達率很高，所以HER2蛋白是骨肉瘤治療的理想靶點。本實驗采用抗殼聚糖抗體與抗HER2抗體做成抗體聯(lián)合體，結合在包埋有阿霉素的乙二醇殼聚糖納米載體表面，通過生物靶向作用，使抗原抗體特異性結合，將藥物靶向輸送至骨肉瘤細胞的藥物輸送體系。此藥物靶向體系將成為一種新的藥物靶向體系，為骨肉瘤或其他腫瘤的靶向藥物輸送提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：乙二醇殼聚糖、阿霉素、烏頭酸酐、乙酸乙酯、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、透析膜（截留分子量12 000）、抗殼聚糖抗體與抗HER2抗體（Santa Cruz，上海起發(fā)生物有限公司）。

1.1.2 實驗儀器：倒置共聚焦顯微鏡（OLYMPUS，日本），自動溫控細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Form），Olympus OV100小動物顯像系統(tǒng)（OLYMPUS，日本）

1.1.3 實驗細胞和動物：MG-63細胞（來自于骨肉瘤裸鼠），用于體外細胞攝取實驗。14只骨肉瘤裸鼠皆為6～8周齡雌性純系無胸腺裸鼠，體質(zhì)量19．44～23．31 g，平均21．31 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心[SYKZ（浙）2005-0061]提供，用于體內(nèi)藥物的靶向分布檢測。將骨肉瘤裸鼠隨機分為2組：每組各7只。

1.2 方法

1.2.1 納米藥物的制備：

1.2.1.1 乙二醇殼聚糖（glycol chitosan，GC）納米粒的制備：取GC溶于蒸餾水中，在恒溫磁力攪拌器上以一定轉速勻速攪拌3 h，用探頭型超聲處理器超聲2 min（功率60 W），超聲時以開5 s，關1 s的脈沖形式進行，處理5次共10 min。后加入不同濃度的三聚磷酸鈉（tripolyphosphate，TPP）水溶液10 mL，觀察到明顯的乳光時立即停止，維持反應30 min，即得到納米粒子懸浮液。

1.2.1.2 阿霉素包埋的殼聚糖納米粒（glycol chitosan-doxorubicin，GC-Dox）合成：①順式烏頭酰基Dox的合成（以下步驟需避光進行）：13.46 mg烏頭酸酐溶于1 mL二氧雜環(huán)乙烷中配置成烏頭酸酐溶液，Dox（10 mg）溶解于400 μL吡啶中。將烏頭酸酐溶液緩慢滴加至Dox溶液中，4 ℃攪拌過夜。5 mL氯仿和5 mL 5%碳酸氫鈉溶液洗滌2次，倒掉氯仿，所剩溶液用乙酸乙酯萃取真空干燥，制得順式烏頭?；鵇ox。②GC-Dox納米粒的合成：100 mg GC溶于10 mL蒸餾水，以10 mL甲醇稀釋。順式烏頭?；鵇ox緩慢加入至GC溶液中，再加入EDC和NHS，室溫緩慢攪拌過夜。所得產(chǎn)物以截留分子量12 000透析膜透析，冷凍干燥保存。

1.2.1.3 AbC-GC-Dox納米粒的制備：制備的GC-Dox納米粒，在37 ℃水浴條件下，與抗殼聚糖抗體與抗HER2抗體特異性結合，制成AbC-GC-Dox納米粒。

1.2.2 載藥量測定：將初次制備的AbC-GC-Dox納米粒懸浮液用超濾離心管，4 000 r/min離心分離納米微粒，在波長480 nm處，以去離子水為空白對照，用紫外可見分光光度計測定上清液中的AbC含量，并按照下列公式計算包封率和載藥量。計算公式如下：

載藥量=[投藥量（MBq）-剩余液體中的藥量（MBq）]/納米微粒質(zhì)量（g）×100%

包封率=[（投藥量（MBq）-剩余液體中的藥量（MBq）]/投藥量（MBq）×100%

1.2.3 體外釋藥曲線分析：本實驗采用動態(tài)透析法測定體外釋藥曲線：稱取不同載藥量的含放射性125I納米粒0.2 g置于透析袋內(nèi)，分別浸入200 mL PBS緩沖液中，置恒溫磁力攪拌儀上37 ℃持續(xù)攪拌，分別于0.5、1、2、4、8、24、48 h時吸取20 mL透析液樣品，并加入相同體積的PBS緩沖液補足容量。用活度儀分別測定樣品的放射性活度，并計算累積藥物釋放率，繪制累積釋放曲線。

1.2.4 體外腫瘤細胞攝取實驗：將實驗分為2組：GC-Dox納米粒組作為對照組，AbC-GC-Dox納米粒組作為實驗組。選用HER2+裸鼠骨肉瘤細胞系MG-63細胞作為實驗細胞株。使用含10%小牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)該細胞。將對照組與實驗組藥物加入培養(yǎng)板，經(jīng)過1、3、6 h后收集細胞于免疫熒光顯微鏡下觀測熒光強度。

1.2.5 體內(nèi)抗腫瘤藥物的靶向性研究：用胰酶消化收集MG-63細胞，BPS洗滌并重懸，制成1×107/mL的細胞懸液。6～8周齡雌性純系無胸腺裸鼠14只，皮下注射0.2 mL，接種前測定裸鼠體質(zhì)量。動物將在無病原體的條件下飼養(yǎng)。當腫瘤長到0.6～0.7 cm大小的時候（通常接種后7～10 d），將骨肉瘤裸鼠隨機分成2組：每組7只。分別給予相應藥物，對照組：GC-Dox納米粒；實驗組藥物：AbC-GC-Dox納米粒，由尾靜脈注射藥物。注射藥物后1、6、24 h后，分別將裸鼠在Olympus OV100小動物顯像系統(tǒng)進行顯像觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料2組間比較采用成組設計資料t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電鏡圖像 通過本實驗制備納米粒的方法制得的AbC-GC-Dox納米粒在電鏡下觀察所得圖像見圖1。從透射電鏡觀察其外觀為規(guī)整的球形，大小稍有差異，分散度較好。

圖1 納米粒的電鏡透射照片（×40 000）

2.2 載藥量與包埋率 本實驗制得的AbC-GC-Dox納米粒，根據(jù)上述實驗方法及載藥量和包埋率的計算公式，測得本實驗的包封率為89．73%，載藥量為9.96%。

2.3 累積釋放曲線 不同的載藥量在8～24 h后的釋放趨于平衡，累積釋放率為（84.5±1.3）%，載藥量越低釋效應越輕，達到平衡時間較長（24 h），緩釋作用更為明顯（見圖2）。

圖2 不同載藥量納米粒的累積釋放曲線

2.4 體外腫瘤細胞攝取實驗與平均攝取量 由體外免疫熒光實驗顯微鏡下觀察得知，實驗組MG-63細胞攝取納米粒藥物的量隨著時間的延長而逐漸增多，且明顯強于同一時間點對照組MG-63細胞攝取納米粒的量（見圖3）。進一步通過IPP6.0圖片處理軟件對圖3的圖片平均光密度進行分析，結果顯示：實驗組MG-63細胞攝取平均納米粒藥物的量明顯強于同一時間點對照組MG-63細胞平均攝取納米藥物的量（P＜0.05）（見圖4）。

2.5 納米粒藥物的體內(nèi)靶向性研究 通過Olympus OV100小動物顯像系統(tǒng)對2組裸鼠鏡下觀察所見：注射藥物1、6、24 h后，實驗組裸鼠攝取納米藥物的量隨著時間的延長而逐漸增多，且明顯強于同一時間點對照組裸鼠攝取納米粒的量（P＜0.05）（見圖5）。

圖3 體外腫瘤細胞攝取AbC-GC-Dox納米粒的免疫熒光圖（×200）

圖4 實驗組與對照組MG-63細胞的平均納米藥物攝取量

3 討論

本實驗采用的雙抗體靶向阿霉素納米藥物，由殼聚糖、雙抗體和抗腫瘤藥物阿霉素構成。它是以殼聚糖為基質(zhì)，通過膜透析技術，制備殼聚糖負載阿霉素納米粒，然后將抗殼聚糖抗體與抗HER2抗體連接于負載阿霉素納米粒研制而成。此納米藥物是通過抗體聯(lián)合體靶向輸送至骨肉瘤細胞表面，與骨肉瘤細胞表面特異性抗原結合，通過細胞內(nèi)吞作用，使藥物進入骨肉瘤細胞內(nèi)，達到殺滅腫瘤的治療作用。此特異性的結合方式，可使藥物濃聚于腫瘤靶區(qū)，這樣既提高了腫瘤靶區(qū)的藥物濃度，同時也降低了化療藥物的使用量和對正常組織的不良反應[8-9]。到達靶區(qū)并被內(nèi)吞的藥物以受控緩釋的方式從納米藥物載體中釋放，對靶區(qū)的細胞予以長期高效的治療作用。

納米藥物，是以納米材料作為載體，直徑為0.1～100 nm的藥物顆粒[10]。載體直徑過小不能包埋足量的抗腫瘤藥物，過大不能達到靶向治療的目的。同樣藥物顆粒的直徑也必須是納米級的，過大不能被載體所包埋。本實驗所制得的阿霉素納米藥物的直徑為17 nm，具有良好的穩(wěn)定性，在納米粒載體中（GC-Dox）Dox包封率為89．73%，載藥量為9.96%。

納米粒是采用乳化聚合的方法制得，將GC溶于水中，并將順式烏頭酰基Dox緩慢加入至GC溶液中，再加入EDC和NHS，即所謂的碳化二亞胺法將抗體聯(lián)合體與納米藥物連接制成靶向納米藥物。人體生理pH值一般為7.35～7.45，而殼聚糖只溶解于pH值＜6.5的溶液，所以我們選擇殼聚糖衍生物GC作為納米?；|(zhì)，可溶于pH值范圍更廣的溶液中。這樣所得的溶液具有良好的分散度和穩(wěn)定性。細胞膜本身帶負電荷，容易接近并且吸收帶正電荷的物質(zhì)，所以帶正電荷的殼聚糖既具有良好的生物相容性，又具有良好的細胞膜穿透性，且容易被血漿中的溶解酵素降解。再加上抗原抗體結合的特異性，使得實驗所制備的AbC-GC-Dox具有分散度好、穩(wěn)定性好、生物相容性好、細胞穿透性與靶向性強、藥物包封率和載藥量高、緩釋可控及制備方法比較簡單等特點。

圖5 實驗組與對照組納米粒藥物的體內(nèi)靶向性結果（粉色箭頭代表皮下腫瘤）

抗體聯(lián)合體靶向納米藥物在靶向過程中除了需要具備以上特性之外，還需要克服血管內(nèi)血流對微粒產(chǎn)生的沖擊力，當抗原抗體復合物之間的特異性結合力與殼聚糖和細胞膜正負電荷吸引力之和大于毛細血管的線性血流速度時，靶向藥物聚集在骨肉瘤靶組織，并被內(nèi)吞的可能性就增大。本實驗采用裸鼠尾靜脈注射藥物，觀察裸鼠體內(nèi)皮下骨肉瘤的靶向分布差異。通過小動物顯像系統(tǒng)觀察對照組和實驗組，結果表明抗體聯(lián)合體靶向納米藥物在骨肉瘤靶組織中濃聚效果明顯好于未連接抗體聯(lián)合體的納米藥物，明顯提高靶區(qū)的阿霉素濃度，并且降低了非靶區(qū)的阿霉素濃度，極大減低了化療過程中的不良反應。

本實驗得到了我們預期的結果，這與我們選擇的骨肉瘤上的一個特異性的靶點是密不可分的。這就是HER2蛋白，HER2原癌基因編碼的HER2蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是人表皮生長因子受體（EGFR）家族成員之一，在細胞傳導中發(fā)揮重要作用，是細胞增殖、分化和存活的重要調(diào)節(jié)因子[11]。HER2在正常細胞中低表達或不表達，而在約25%～30%的乳腺癌、卵巢癌和胃癌，以及35%～45%的胰腺癌和高達90%的大腸癌組織中存在HER2的過度表達[12-14]。在骨肉瘤中，該蛋白表達率為60%[15]。因此我們把HER2作為上述腫瘤治療的特異性靶點，本實驗的各項結果驗證了我們前期的實驗假設，證實了通過抗HER2抗體與HER2蛋白的特異性結合可以大大地提高納米藥物抗腫瘤的靶向特異性，這也是本實驗的一個重要創(chuàng)新點。

綜上所述，本實驗中所使用的抗體聯(lián)合體靶向納米藥物不僅制備過程簡單，而且其具有良好的穩(wěn)定性、生物相容性、細胞穿透性，最重要的是具有極強的特異性靶向能力。在提高靶向治療腫瘤的同時，還能降低藥物的不良反應。它的這些特性對臨床上腫瘤靶向治療提供了一個新的發(fā)展方向，可以進一步推動納米載體給藥系統(tǒng)的發(fā)展。

[1] Farokhzad OC, Cheng J, Teply BA, et al. Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(16): 6315-6320.

[2] Zhang Y, Kohler N, Zhang M. Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake[J]. Biomaterials, 2002, 23(7): 1553-1561.

[3] Ambruosi A, Yamamoto H, Kreuter J. Body distribution of polysorbate-80 and doxorubicin-loaded [14C] poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles after i.v. administration in rats [J]. Drug Target, 2005, 13(10): 535-542.

[4] Box VG. The intercalation of DNA double helices with doxorubicin and nogalamycin[J]. Mol Graph Model, 2007, 26(1): 14-19.

[5] 韓濤. 李富榮. 周漢新. 阿霉素納米粒靶向藥物制劑的研究進展[J]. 中國藥物與臨床, 2004, 4(10): 737-740.

[6] Wang ZH, Wang ZY, Sun CS, et al. Trimethylated chitosanconjugated PLGA nanoparticles for the delivery of drugs to the brain[J]. Biomaterials, 2010, 31(5): 908-915.

[7] Strand SP, Lelu S, Reitan NK, et al. Varum KM. Molecular design of chitosan gene delivery systems with an optimized balance between polyplex stability and polyplex unpacking [J]. Biomaterials, 2010, 31(5): 975-987.

[8] Lee JH, Jung SW, Kim IS. Polymeric nanoparticle composed of fatty acids and poly (ethylene glycol) as a drug carrier[J]. Int J Pharm, 2003, 251(1-2): 23-32.

[9] Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long-circulating and target-specific nanoparticles:theory to Particle[J]. Pharmacol Rev, 2001, 53(2): 283-318.

[10] Thrall JH. Nanotechnology and medicine[J]. Radiology, 2004, 230(2): 315-318.

[11] Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer[J]. Science, 1989, 244(4905): 707-712.

[12] Moasser MM. The oncogene HER2: its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis [J]. Oncogene, 2007, 26(45): 6469-6487.

[13] Verri E, Guglielmini P, Puntoni M, et al. HER2/neu oncoprotein overexpression in epithelial ovarian cancer: evaluation of its prevalence and prognostic significance. Clinical study [J]. Oncology, 2005, 68(2-3): 154-161.

[14] Tsiambas E, Karameris A, Dervenis C, et al. HER2/neu expression and gene alterations in pancreatic ductal adenocarcinoma: a comparative immunohistochemistry and chromogenic in situ hybridization study based on tissue microarrays and computerized image analysis[J]. JOP, 2006, 7(3): 283-294.

[15] Ahmed N, Salsman VS, Yvon E, et al. Immunotherapy for osteosarcoma: genetic modification of T cells overcomes low levels of tumor antigen expression[J]. Mol Ther, 2009, 17 (10): 1779-1787.

（本文編輯：胡苗苗）

Experimental study on the development and targeting effect of nanoparticles of double-antibody complex

and adriamycin loaded

ZHENG Yijing, ZHANG Xiaolei, LIN Yan,WU Yaosen, ZHANG Qiong. Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To synthesize double antibody complex-glycol chitosan doxorubicin nanoparticles (Abc-GC-Dox) and study its targeting effect of osteosarcoma in mice. Methods: Abc-GC-Dox and GC-Dox were prepared by emulsion polymerization method, in vitro immunofluorescence was used to study the intake test of HER2+carried MG-63 cells in Abc-GC-Dox and GC-Dox. Fourteen mice with osteosarcoma were randomly divided into 2 groups. After corresponding treatment, different drugs (Abc-GC-Dox and GC-Dox) were given via tailvein, and the targeting effect was observed. Results: Stable Abc-GC-Dox and the quantity of drug ? loading and entrapment were gotten. Compare to GC-Dox, there was a better drug concentration in osteosarcoma in mice, which showed a well targeting effect in vivo. Conclusion: Abc-GC-Dox is successfully developed and the nanoparticles demonstrated targeting aggregating distribution. In future, Abc-GC-Dox can be a potential drug for the clinical treatment of tumors.

double antibody complex; doxorubicin; ethylene glycol chitosan; nanoparticle; targeted therapy; osteosarcoma; nude mice

R730.53

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.001

2015-01-06

浙江省自然科學基金資助項目（Y2110466，Y21104 67）；溫州市科技局科技計劃項目（S20100048）。

鄭亦靜（ 1987-），男，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

林焱，副主任醫(yī)師，碩士生導師，Email：wzlinyan@ 126.com。