洪輝華，楊珺超，高潤(rùn)娣，趙瑋，朱淵紅，蔡宛如

（1．浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 呼吸科，浙江 杭州 310005）

·論 著·

芪冬活血飲對(duì)急性肺損傷大鼠TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響

洪輝華1，楊珺超1，高潤(rùn)娣1，趙瑋1，朱淵紅1，蔡宛如2

（1．浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 呼吸科，浙江 杭州 310005）

目的：通過(guò)觀察芪冬活血飲對(duì)脂多糖所致大鼠急性肺損傷（ALI）的干預(yù)作用，明確芪冬活血飲的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，高、中、低劑量中藥治療組5組。氣道內(nèi)滴注脂多糖建立急性肺損傷模型。中藥治療組以芪冬活血飲灌胃，空白組及模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組大鼠造模后24 h處死，收集標(biāo)本。結(jié)果：①芪冬活血飲可以減輕肺損傷大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。②ALI大鼠肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-10水平增高，芪冬活血飲降低TNF-α、IL-1β水平，升高IL-10水平，高劑量組與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。③ALI大鼠Toll樣受體-4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65蛋白及mRNA表達(dá)增加，芪冬活血飲可減少TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA表達(dá)，并有一定的劑量相關(guān)性。結(jié)論：芪冬活血飲對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB p65炎癥信號(hào)通路，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β水平，升高抗炎細(xì)胞因子IL-10水平有關(guān)。

急性肺損傷；Toll樣受體-4；核轉(zhuǎn)錄因子κB；細(xì)胞因子

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）是一種呼吸系統(tǒng)急危重癥，是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性低氧性呼吸衰竭。目前認(rèn)為腫瘤壞死因子-α（tumornecrosis factor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、一氧化氮（nitric oxide，NO）等促炎癥遞質(zhì)大量釋放，IL-10、IL-13等抗炎遞質(zhì)分泌相對(duì)不足，導(dǎo)致體內(nèi)促炎/抗炎遞質(zhì)嚴(yán)重失衡是ALI發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制［1-2］。

TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路對(duì)ALI促炎/抗炎遞質(zhì)平衡起關(guān)鍵的調(diào)控作用。炎癥反應(yīng)的本質(zhì)是宿主識(shí)別外界致炎信號(hào)并進(jìn)行適應(yīng)性應(yīng)答的過(guò)程。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是免疫細(xì)胞識(shí)別病原微生物致炎組分，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的重要模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），其中脂多糖（lipoplolysaccharide，LPS）所致的炎癥反應(yīng)主要由TLR4負(fù)責(zé)識(shí)別。TLR4與LPS結(jié)合后，經(jīng)可通過(guò)多種途徑調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化，活化的NF-κB上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-8等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，致使體內(nèi)炎癥失衡最終導(dǎo)致ALI發(fā)生發(fā)展[3-5]。

在中醫(yī)理論和實(shí)踐上，ALI屬于熱毒瘀結(jié)、氣陰兩虛病癥，課題組在清熱解毒、祛瘀通腑、益氣養(yǎng)陰為主的治療原則上，采用黃芪、麥冬、虎杖、當(dāng)歸等藥物組成“芪冬活血飲”，前期研究已經(jīng)證實(shí)“芪冬活血飲”能減少促炎癥遞質(zhì)TNF-α、內(nèi)皮素-1、肺表面活性蛋白A分泌，增加抗炎遞質(zhì)IL-10分泌，糾正促炎/抗炎遞質(zhì)失衡，對(duì)ALI大鼠具有良好的保護(hù)作用[6-9]。然而，芪冬活血飲調(diào)控炎癥遞質(zhì)釋放的機(jī)制尚不明確。

本研究擬觀察芪冬活血飲對(duì)ALI大鼠肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA和肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-10水平的影響，明確芪冬活血飲對(duì)TLR4/ NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響，探討其調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只，清潔級(jí)，體 質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 供試藥品 芪冬活血飲（黃芪20 g、麥冬12 g、虎杖20 g、當(dāng)歸12 g）藥材由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制成質(zhì)量體積比1:1湯劑，滅菌處理后，-4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 LPS（coli 055:B5）（批號(hào)：L2880）購(gòu)自Sigma公司。大鼠TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)： RT20135528B）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)： RT20138526B）、大鼠IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)：RT20131025B）購(gòu)自RND公司。免疫組織化學(xué)二步法Envision試劑盒（批號(hào)：26F1779A）購(gòu)自DAKO公司，NF-κB p65免疫組織化學(xué)試劑盒（批號(hào)：SC-372G211）、TLR4免疫組織化學(xué)試劑盒（批號(hào)：SC-30002A2510）、DAB顯色液（批號(hào)：08M1779A）均購(gòu)自santacruz公司。Trizol Reagent（批號(hào)：40950732） 購(gòu)自Bio Basic公司；RTPCR定量試劑盒（批號(hào)：DRR041A），cDNA合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：CK101D）， DNA Marker（批號(hào)：DL 2000）均購(gòu)自TAKARA公司。

1.4 主要儀器 石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司HM 340E型），酶標(biāo)分析儀（北京朗普新技術(shù)有限公司DNM-9602型），熒光顯微鏡攝像機(jī)（日本OLYMPUS公司BX20型），定量PCR儀器（美國(guó)ROCHE公司ABI 7500型），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司Certrifuge 5417R型），電泳系統(tǒng)（Bio-RAD公司 Mini-Proten Tetra System型），凝膠成像儀（Bio-RAD公司ChemiDoc XRS+System型）。

1.5 模型建立 各組大鼠均經(jīng)異氟烷霧化麻醉，在距大鼠環(huán)狀軟骨約0.5 cm處作大小約0.3 cm切口，分離至氣管；將LPS配置成3 mg/mL溶液，經(jīng)針筒按照1.5 mg/kg劑量緩慢注入大鼠氣管中，然后將大鼠左右上下?lián)u晃，使LPS均勻分布于肺組織中?？瞻捉M采用等量0.9%氯化鈉溶液氣管內(nèi)滴注。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 健康雄性SD大鼠50只按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，即空白組，模型組，低、中、高劑量芪冬活血飲治療組（簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組），每組10只。低、中、高劑量組造模前24、12 h及造模后12 h分別以4、8和16 mL/kg芪冬活血飲灌胃，模型組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)以8 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃。造模后24 h腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠（劑量為3 mL/kg），處死動(dòng)物采集標(biāo)本。

1.7 肺泡灌洗液 暴露頸部氣管及兩肺，左肺用于肺泡灌洗。結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)由頸部氣管插入5.5號(hào)靜脈注射針至左主支氣管，用無(wú)菌手術(shù)縫合線由氣管食管間隙綁扎氣管及靜脈注射針，使其固定并密封。注射針接5 mL針筒注入3 mL 0.9%氯化鈉溶液見(jiàn)左肺膨起，輕輕按摩左肺30 s，再用20 mL 針筒緩慢回抽，反復(fù)3次，回收率在50%以上?；厥找悍盅b入離心管中，低速離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，上清液-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA法測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-10水平。操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.8 肺組織 開(kāi)胸取右肺，取右下肺置痰杯-80 ℃冰箱保存PCR測(cè)定用。余肺中性緩沖甲醛（pH 7.4）固定24 h后，石蠟包埋切片。其中各組取2只用于HE染色，剩余大鼠肺組織行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

①經(jīng)常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組肺組織病理變化。

②以免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)肺組織TLR4、NF-κB p65的蛋白表達(dá)，在細(xì)胞漿內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。并參照文獻(xiàn)[10] 計(jì)算免疫組織化學(xué)積分：將陽(yáng)性細(xì)胞按染色強(qiáng)度打分，無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分（染色深淺需與背景比較）；再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比打分，0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞小于等于10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為大于75%；兩者的乘積為免疫組織化學(xué)表達(dá)積分。

③RT-PCR法檢測(cè)肺組織TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)。肺組織液氮保存，采用Trizol一步法試劑盒 提取肺組織細(xì)胞總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA純度、完整性，紫外分光光度儀定量后，取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的mRNA全基因序列，采用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件和引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行PCR引物的設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。引物序列：cav-1的上游引物為5’-GATT GCTCAGACATGGCAGTTTC-3’，下游引物為5’-CACTCGAGG TAGGTGTTTCTGCTAA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度135 bp；NF-κB p65上游引物為5’-GGACTGCCGGGATGGCTTCTAT-3’，下游引物為5’-GCTTGCTCCAGGTCTCGCTTCTT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度108 bp；18-s的上游引物為5’-GAATTCCCAGT AAGTGCGGGTCATA-3’，下游引物為5’-CGAGGGCCTC ACTAAACCATC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為105 bp。進(jìn)行PCR 反應(yīng)。電泳分離、顯色成像。以DNA maker為標(biāo)準(zhǔn)， Marker為T(mén)AKARA DL 2000，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小來(lái)鑒定目的基因片段，以18-s光度值為內(nèi)參考，以待測(cè)基因與18-s的比值為待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因的相對(duì)表達(dá)水平以相對(duì)表達(dá)量（2-△Ct× 104）進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，1 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃，10 s；64 ℃，25 s（收集熒光）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 模型組大鼠有2只在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡，統(tǒng)計(jì)處理時(shí)去除各組與模型組相同編號(hào)大鼠數(shù)據(jù)。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料各組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)比較 空白組大鼠肺呈均勻淡粉紅色，包膜光滑，彈性好，表面未見(jiàn)病損灶；光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無(wú)水腫，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)水腫液，偶見(jiàn)肺間質(zhì)白細(xì)胞少量浸潤(rùn)。模型組大鼠肺體積顯著增大，呈暗紅色，包膜下充血水腫明顯，彈性降低，表明可見(jiàn)斑片出血；光鏡下肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)廣泛積液水腫，肺泡間隔增厚，肺泡變小伴出血。各劑量治療組肺包膜下充血水腫均較模型組減輕，鏡下肺泡結(jié)構(gòu)不同程度破壞，肺泡內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但程度均輕于模型組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織HE病理圖片（HE，×100）

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子比較 空白組TNF-α、IL-1β、IL-10含量均最低，與其余各組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組TNF-α、IL-1β含量最高，而IL-10含量均低于各治療組；和低劑量組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與中劑量組、高劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

三治療組TNF-α、IL-1β含量比較，低劑量組最高，高劑量組最低。高劑量組與其余兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組與中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三治療組中IL-10含量低劑量組最低，高劑量組最高。低劑量組與中、高劑量組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中、高劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子比較（n=8，±s，pg/mL）

表1 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子比較（n=8，±s，pg/mL）

與空白組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01，cP＜0.05；與高劑量組比：dP＜0.01，eP＜0.05；與中劑量組比：fP＜0.01

2.3 各組大鼠免疫組織化學(xué)TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)及積分比較 空白組可見(jiàn)少許肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)，但染色程度低，其余細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)；模型組及各劑量組NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布在氣道黏膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中，在炎性細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均有明顯表達(dá)，各劑量組NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比均低于模型組，其中高劑量組低于低劑量組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)情況（Envision，×200）

空白組可見(jiàn)少許血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞TLR4陽(yáng)性表達(dá)，染色程度低，其余細(xì)胞基本未見(jiàn)表達(dá)；模型組和各劑量組TLR4主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮及少量的炎癥細(xì)胞上，模型組表達(dá)程度較NF-κB p65低，但染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞比例仍明顯高于其余各組；高劑量組低于低劑量組。見(jiàn)圖3。

圖3 各組肺組織TLR4蛋白表達(dá)情況（Envision，×200）

免疫組織化學(xué)TLR4、NF-κB p65積分：均為空白組最低，模型組含量最高?？瞻捉M和其余各組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組NF-κB p65積分和低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與中、高劑量組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；模型組TLR4積分與中、低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)積分比較（n=6，±s）

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)積分比較（n=6，±s）

與空白組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01，cP＜0.05；與高劑量組比：dP＜0.01

高、中、低劑量組間TLR4、NF-κB p65積分比較，均為低劑量組最高，高劑量組最低。三組間比較，除NF-κB p65積分低、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），余兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠TLR4、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 TLR4、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量均為空白組最低，模型組最高。TLR4空白組和其余各組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組和中、高劑量芪冬活血飲組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組與低劑量芪冬活血飲組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB p65模型組和其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。NF-κB p65空白組和中、高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

高、中、低劑量組間TLR4、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，低劑量組最高，高劑量組最低。三組間比較，低劑量組與中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組與中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組肺組織mRNA表達(dá)結(jié)果

表3 各組大鼠肺組織mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s 2-△Ct× 104）

表3 各組大鼠肺組織mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s 2-△Ct× 104）

與空白組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01；與高劑量組比：dP＜0.01，eP＜0.05；與中劑量組比：fP＜0.01，gP＜0.05

3 討論

ALI/ARDS是一種呼吸系統(tǒng)急危重癥，以肺微血管通透性增加引發(fā)的彌漫性肺間質(zhì)和肺泡腔水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理改變[1]。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)廣泛積液水腫伴出血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，各芪冬活血飲治療組損傷程度均有不同程度的減輕，其中以高劑量組效果最為明顯。這表明采用LPS氣道內(nèi)滴注方法復(fù)制大鼠肺損傷模型成功，芪冬活血飲對(duì)其有保護(hù)作用，且劑量越高保護(hù)作用越強(qiáng)。

革蘭陰性桿菌感染釋放的LPS是導(dǎo)致ALI的最主要原因[11]。進(jìn)入體內(nèi)的LPS被PRRs識(shí)別并實(shí)現(xiàn)炎 癥信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、NO等促炎遞質(zhì)大量 分泌，IL-10、IL-13等抗炎遞質(zhì)分泌相對(duì)不足，致使 體內(nèi)促炎/抗炎遞質(zhì)失衡是ALI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中TNF-α起關(guān)鍵作用，IL-1β起協(xié)同作用。TNF-α可刺激巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞大量分 泌IL-1β、IL-8等促炎細(xì)胞因子及血小板激活因子、 前列腺素、NO等次級(jí)炎癥遞質(zhì)；而IL-1β可增強(qiáng)組織 細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性，并刺激TNF-α、IL-8、E-選擇素、P-選擇素等其他炎癥遞質(zhì)合成分泌[2，12-13]。兩者相互促進(jìn)，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致AIL/ARDS。而LPS在刺激TNF-α、IL-1β等促炎遞質(zhì)分泌同時(shí)，也刺激IL-10、IL-4等抗炎遞質(zhì)的分泌。IL-10是體內(nèi)重要的抗炎遞質(zhì)，可直接抑制TNF-α和IL-1β的合成分泌及過(guò)度激活重建體內(nèi)炎癥遞質(zhì)及抗炎遞質(zhì)的平衡[14]。

TLR4/NF-κB通路是啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典通路，在LPS所致的急性肺損傷中起著重要作用。目前已經(jīng)明確TLR4是識(shí)別LPS并介導(dǎo)其炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的最主要的PRRs。TLR4與LPS結(jié)合后，主要經(jīng)由髓樣分化因子88（mycloid differentiation factor 88，MyD88）途徑逐級(jí)傳遞信號(hào)至腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor-associated factor-6 TRAF6），活化后的TRAF6與下游轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-β激活激酶1[transforming growth factor-β （TGF-β）activated kinase-1 TAK1] 、TAK1結(jié)合蛋白1、2、3（TAK1-binding protein TAB）形成復(fù)合物，磷酸化NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB），導(dǎo)致IκB降解激活NF-κB[3-4，15-16]。通常所說(shuō)的NF-κB是指在NF-κB/Rel家族成員中具有主要生物活性的p50/p65異源二聚體，激活后的NF-κB迅速移位至細(xì)胞核內(nèi)，大量上調(diào)IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等促炎細(xì)胞因子大量表達(dá)[5]。

各治療組TNF-α、IL-1β較模型組低，IL-10較模型組高，表明芪冬活血飲既能降低TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子水平，又能增加抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，從而減輕肺組織損傷。再次證實(shí)芪冬活血飲能調(diào)控ALI大鼠促炎/抗炎遞質(zhì)平衡，對(duì)肺損傷大鼠具有保護(hù)作用[6-9]。三治療組間比較，高劑量組與低劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明隨劑量的增加，其調(diào)控炎癥遞質(zhì)平衡作用增強(qiáng)。

模型組TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA表達(dá)均較空白組增加，且差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LPS可明顯刺激ALI大鼠肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA表達(dá)。TLR4、NF-κB p65免疫組織化學(xué)積分模型組與高劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示隨劑量增加芪冬活血飲降低ALI大鼠TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)作用增強(qiáng)。TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)中、高劑量組與模型組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明中高劑量芪冬活血飲均能明顯抑制TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與低劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在中、低劑量后芪冬活血飲抑制TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)的作用隨劑量增加而增強(qiáng)，但中等劑量后其作用程度并不隨劑量增加而增強(qiáng)。

以上結(jié)果表明芪冬活血飲對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB p65炎癥信號(hào)通路，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β水平，升高抗炎細(xì)胞因子IL-10水平糾正炎癥失衡有關(guān)。

[1] American Thoracic Society.Round Table Conference.Acute lung injury[J] .Am J Respir Crit Care Med,1998,158(2): 675-679.

[2] Puneet P,Moochhala S,Bhatia M.Chemokines in acute re-spiratory distress syndrome[J] .Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,288(1): L3-L15.

[3] Takeda K,Kaisho T,Akira S.Toll-like receptors[J] .Annu Rev Immunol,2003,21(4): 335-376.

[4] Barton GM,Medzhitov R.Toll-like receptor signaling path ways[J] .Science,2003,300(6): 1524-1525.

[5] Sun Z,Andersson R.NF-κB activation and inhibition: a review[J] .Shock,2002,18(2): 99-106.

[6] 蔡宛如,洪輝華,駱仙芳,等.芪冬活血飲對(duì)油酸致大鼠急性肺損傷干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J] .中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(9): 830-832.

[7] 蔡宛如,洪輝華,駱仙芳,等.芪冬活血飲對(duì)油酸致大鼠內(nèi)皮素-1水平的影響[J] .浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,32 (2): 158-160.

[8] 李志軍,丁志山,董雷,等.芪冬活血飲對(duì)急性肺損傷大鼠肺表面活性蛋白A在肺與大腸表達(dá)的影響及相關(guān)性研究[J] .中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(3): 698-702.

[9] 李敏靜,李志軍,鄭繼生,等.急性肺損傷時(shí)大鼠各組織SP-A的變化及其相關(guān)性研究[J] .中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(4): 933-937.

[10] 許良中,楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J] .中國(guó)癌癥雜志,1996,6(4): 229-231.

[11] Bone RC.The pathogenesis of sepsis[J] .Ann Intern Med,1991,115(6): 457-469.

[12] Van der Poll T,Lowry SF.Tumor necrosis factor in sepsis: mediator of multiple organ failure or essential part of host defense?[J] .Shock,1995,3(1): 1-12.

[13] Kolb M,Margetts PJ,Anthony DC,et al.Transient expres-sion of IL-1beta induces acute lung injury and chronic re-pair leading to pulmonary fibrosis[J] .J Clin Invest,2001,107(12): 1529-1536.

[14] Shanley TP,Vasi N,Denenberg A.Regulation of chemo-kine expression by IL-10 in lung inflammatory[J] .Cytokine,2000,12(7): 1054-1064.

[15] Medzhitov R.Toll-like receptors and innate immunity[J] .Nat Rev Immunol,2001,1(2): 135-145.

[16] T Kawai,S Akira.Toll-like receptor downstream signaling [J] .Arthritis Res Ther,2005,7(1): 12-19.

（本文編輯：吳健敏）

The effect of Qidong Huoxue Decoction on TLR4/NF-κB inflammatory signaling pathway in acute lung in- jury rats

HONG Huihua1,YANG Junchao1,GAO Rundi1,ZHAO Wei1,ZHU Yuanhong1,CAI Wanru2.
1.De- partment of Respiration,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310006; 2.Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310005

Objective:To investigate the protective effect of qidonghuoxue decoction (QD) on acute lung injury (ALI) in rats induced by lipopolysaccharide (LPS),and to explore the mechanism.Methods:Fifty SD rats were divided into five groups randomly: control group,model group,high-dose QD group,medium-dose QD group,low-dose QD group.The ALI model was established by intratracheal instillation of LPS.QD was administrated via esophagus to rats in QD groups; NS was substitution in control and model groups.All rats were executed 24 h after modeling,bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were collected.Results:①HE staining showed that QD could reduce alveolar damage,pulmonary edema and inflammatory cells infiltration in rats with ALI.②TNF-α,IL-1β,IL-10 levels were increased in rats with ALI,QD decreased the levels of TNF-α and IL-1β,increased the level of IL-10,there was significant difference between the high-dose and lowdose group (P＜0.01).③The protein and mRNA expression of TLR4/NF-κB p65 both increased in rats with ALI,while QD reduced the expression,and the effect was kind of dose-related.Conclusion:QD has a protective effect on ALI induced by LPS in rats,its mechanism is related to inhibit TLR4/NF-kB p65 signaling pathway,decrease IL-1β/TNF-α levels and increase IL-10 level.

acute lung injury; Toll-like receptor 4; nuclear factor-κB; cytokines

R363

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.004

2014-09-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273678）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ12H29003）。

洪輝華（1982-），男，浙江蒼南人，主治醫(yī)師，博士。