于涵，耿軍偉，林枝，薛凌，唐霄雯，鄭斌嬌，呂建新，盧中秋，管敏鑫，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) Attardi線(xiàn)粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325015；3.浙江大學(xué) 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

·論 著·

三個(gè)攜帶線(xiàn)粒體DNA tRNAGln4363T＞C突變的中國(guó)漢族原發(fā)性高血壓家系臨床及遺傳特征分析

于涵1，耿軍偉1，林枝1，薛凌1，唐霄雯1，鄭斌嬌1，呂建新1，盧中秋2，管敏鑫1，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) Attardi線(xiàn)粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325015；3.浙江大學(xué) 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

目的：通過(guò)對(duì)3個(gè)攜帶tRNAGln4363T＞C突變的原發(fā)性高血壓家系進(jìn)行臨床、遺傳和分子特征分析評(píng)估，探討線(xiàn)粒體tRNAGln4363T＞C突變?cè)谀赶颠z傳原發(fā)性高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：PCR擴(kuò)增848例原發(fā)性高血壓患者和254例正常對(duì)照樣本線(xiàn)粒體tRNA基因，對(duì)攜帶tRNAGln4363T＞C突變的3個(gè)家系進(jìn)行家系及線(xiàn)粒體基因相關(guān)分析。結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)3例患者攜帶tRNAGln4363T＞C突變，突變率為0.35%，患者家系中共有母系成員28位，其中12位患有不同程度的高血壓，發(fā)病年齡從27到64歲，平均發(fā)病年齡為44歲，有1位非母系成員患病，母系成員中男性患者的后代均未表現(xiàn)出發(fā)病。3位先證者的線(xiàn)粒體基因全序列分析結(jié)果顯示，除同質(zhì)性tRNAGln4363T＞C突變外，還有64個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別屬于東亞線(xiàn)粒體單體型Z3、Z3和B4d。tRNAGln4363T位點(diǎn)在進(jìn)化上高度保守，該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)tRNAGln二級(jí)結(jié)構(gòu)反密碼子環(huán)的A38位，tRNAGln4363T＞C突變可能影響此位點(diǎn)與反密碼子識(shí)別功能的高保真性和正常tRNA結(jié)構(gòu)的形成及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。結(jié)論：3個(gè)攜帶tRNAGln4363T＞C突變的中國(guó)漢族原發(fā)性高血壓家系母系遺傳特征明顯，線(xiàn)粒體tRNAGln4363T ＞C突變可能是這3個(gè)原發(fā)性高血壓家系發(fā)病的主要分子基礎(chǔ)。3個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNAGln4363T＞C突變的原發(fā)性高血壓家系表現(xiàn)出的同質(zhì)性突變、發(fā)病年齡及外顯率不同等表型差異特征提示核修飾基因、環(huán)境因素和線(xiàn)粒體遺傳背景等可能對(duì)tRNAGln4363T＞C突變家系原發(fā)性高血壓的表型表達(dá)有一定的影響。

原發(fā)性高血壓；線(xiàn)粒體DNA；tRNAGln；基因突變；漢族

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是一種原因不明、以動(dòng)脈血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性疾病，是嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題，高血壓中90%～95%為EH[1]。EH是一種由多因素引發(fā)的復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。EH的發(fā)病被普遍認(rèn)為是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[2]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的EH家系存在母系遺傳特征，提示線(xiàn)粒體基因與核基因共同參與了EH的發(fā)生發(fā)展[3-5]。 線(xiàn)粒體tRNA基因突變是與疾病相關(guān)的突變熱點(diǎn)區(qū)域，已報(bào)道的與EH相關(guān)的線(xiàn)粒體tRNA突變有tRNAMet4435A＞G[6-7]、tRNAMet/tRNAGln4401A＞G[8]、tRNAGln4353T＞C[9]、tRNAThr15927G＞A[10]突變等[11]，所涉及的位點(diǎn)在進(jìn)化上大多高度保守，這些突變可能改變了線(xiàn)粒體tRNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響蛋白質(zhì)合成，造成氧化磷酸化缺陷，降低ATP的合成，增加活性氧的產(chǎn)生[12]，而腦、心等高能量代謝臟器對(duì)ATP的依賴(lài)程度很高，如果線(xiàn)粒體功能缺陷，將會(huì)影響這些臟器功能，可能誘發(fā)EH等多種疾病[13-15]。 因此，本研究對(duì)848例EH患者進(jìn)行線(xiàn)粒體tRNA基因的突變篩查，分析后發(fā)現(xiàn)了35個(gè)變異位點(diǎn)，通過(guò)計(jì)算254例正常對(duì)照者的等位基因頻率、預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和種系發(fā)生分析對(duì)這些變異位點(diǎn)進(jìn)行初步評(píng)估，發(fā)現(xiàn)tRNAGln4363T＞C突變可能是與疾病相關(guān)的致病突變；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)有3例無(wú)親緣關(guān)系的EH患者攜帶此突變。為了進(jìn)一步分析tRNAGln4363T ＞C突變對(duì)EH的影響，本研究對(duì)家系先證者和家系成員進(jìn)行了臨床資料調(diào)查和分子遺傳學(xué)分析，探討tRNAGln4363T＞C突變?cè)贓H中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 848例EH患者中692例來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科、心內(nèi)科的住院和門(mén)診患者，156例來(lái)自體檢中心的患者；同時(shí)收集同一地區(qū)血壓正常，無(wú)高血壓家族史的正常對(duì)照254例，均來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心。本研究對(duì)EH患者中的3個(gè)家系進(jìn)行研究，先證者及其家系成員均居住在溫州地區(qū)。按照溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)管理規(guī)定的方法得到受訪(fǎng)者的知情同意并簽署知情同意書(shū)。對(duì)家系成員的一般情況和血壓進(jìn)行測(cè)量和調(diào)查，采血進(jìn)行常規(guī)和生化檢測(cè)。

1.2 臨床檢查 對(duì)家系成員進(jìn)行一般情況調(diào)查、體格檢查和心血管疾病危險(xiǎn)因子等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢 查[16]。一般情況調(diào)查包括對(duì)性別、年齡、民族、身高、體質(zhì)量及環(huán)境因素包括吸煙、飲酒、飲食等進(jìn)行詳細(xì)詢(xún)問(wèn)，以及有無(wú)高血壓病史、發(fā)病年齡、是否用藥治療、患者的用藥時(shí)間、用藥劑量、是否伴隨其他癥狀等情況調(diào)查。血壓測(cè)量采用間接測(cè)量法，第一和第五柯氏音分別指示收縮壓和舒張壓，測(cè)量血壓前靜坐5 min，安靜狀態(tài)下測(cè)量3次取平均值，對(duì)于血壓≥140/90 mmHg或者服用降壓藥的患者診斷為高血壓[17]。采用心電圖評(píng)估心臟功能，對(duì)家系成員在知情同意后采血進(jìn)行生化檢查，包括血糖、血脂、肝、腎功能以及電解質(zhì)等。

1.3 線(xiàn)粒體基因組突變分析

1.3.1 全基因組DNA提取：抽取家系成員外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，采用DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 4.0，Takara）進(jìn)行全基因組DNA提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 線(xiàn)粒體全序擴(kuò)增：以提取的DNA為模板，采用24對(duì)重疊引物特異性PCR擴(kuò)增線(xiàn)粒體全序[18]，產(chǎn)物純化后測(cè)序，所得結(jié)果用Codoncode Aliger軟件與人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)劍橋序列（Genbank，NC_ 012920）進(jìn)行比對(duì)，分析其中突變位點(diǎn)，同時(shí)，對(duì)家系其他成員和254例正常對(duì)照進(jìn)行線(xiàn)粒體tRNAGln基因PCR擴(kuò)增，測(cè)序并分析，方法同上。

1.3.3 種系發(fā)生學(xué)分析：采用人、鼠、牛、爪蟾4個(gè)物種線(xiàn)粒體DNA全序列進(jìn)行初步分析，17個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)物種進(jìn)行進(jìn)一步分析。將線(xiàn)粒體DNA全序進(jìn)行種間比對(duì)分析，保守性指數(shù)（conservation index，CI）通過(guò)將人的核苷酸變異與其他16種靈長(zhǎng)類(lèi)物種的該位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)計(jì)算得出，即相應(yīng)位點(diǎn)核苷酸為野生型的物種個(gè)數(shù)占17個(gè)物種數(shù)的百分比，如果該值不小于75%說(shuō)明該位點(diǎn)在進(jìn)化上是保守的。

1.3.4 東亞單體型分析：根據(jù)東亞線(xiàn)粒體單體型樹(shù)對(duì)先證者線(xiàn)粒體全基因組的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行單體型分型，以探討在相同單體型的情況下是否存在EH表型的差異[19]。

2 結(jié)果

2.1 臨床及遺傳學(xué)評(píng)估 WHP12家系來(lái)自溫州市平陽(yáng)縣，先證者（I I-1），69歲男性患者，高血壓病史5年，血壓175/76 mmHg，長(zhǎng)期服藥；無(wú)吸煙史，30年飲酒史；血常規(guī)及生化檢測(cè)結(jié)果正常；心電圖示左心室高電壓，T波改變。其弟I I-3，65歲，血壓150/90 mmHg；其他家系成員血壓正常，也無(wú)其他疾病，詳見(jiàn)表1-2。此家系共有母系成員6位，1位死亡，2位患高血壓，平均發(fā)病年齡為64歲，此家系母系成員高血壓發(fā)病率為33.3%，非母系成員的發(fā)病率為0%。WHP13家系來(lái)自溫州市平陽(yáng)縣，先證者（I I-2），45歲女性患者。高血壓病史5年，血壓為160/90 mmHg；無(wú)吸煙飲酒史；血常規(guī)及生化檢查結(jié)果均正常；心電圖正常。其1弟、1妹及3個(gè)兒子均患有高血壓，無(wú)其他疾病，詳見(jiàn)表1-2。此家系共有母系成員11位，1位死亡，7位患有高血壓，平均發(fā)病年齡為33.5歲，此家系母系成員高血壓發(fā)病率為63.6%，非母系成員的發(fā)病率為16.7%。

WHP14家系來(lái)自溫州市永嘉縣，先證者（I I-2），45歲女性患者。高血壓病史2年，血壓值為140/110 mmHg；無(wú)吸煙飲酒史；血常規(guī)及生化檢查結(jié)果均正常；心電圖正常。其母親（I-2），72歲，患有高血壓30余年，血壓值150/85 mmHg，有糖尿病史，血糖偏高，其他檢查均正常；另有一妹患有高血壓；其余家系成員無(wú)高血壓病史，詳見(jiàn)表1-2。此家系共有母系成員10位，3位患有高血壓，平均發(fā)病年齡42歲，母系成員高血壓發(fā)病率為30%，非母系成員的發(fā)病率為0%。

2.2 線(xiàn)粒體基因分析 為進(jìn)一步分析線(xiàn)粒體背景 對(duì)EH外顯率和表現(xiàn)度的影響，本研究對(duì)WHP12、WHP13 和WHP14 3個(gè)家系先證者進(jìn)行了線(xiàn)粒體全基因組的 擴(kuò)增和測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果和修正的人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA 標(biāo)準(zhǔn)劍橋序列（Genbank，NC_012920）比對(duì)[20]，發(fā)現(xiàn)3個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的先證者同時(shí)攜帶tRNAGln4363T ＞C突變，且該位點(diǎn)在17個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)物種中保守性為76.5%[21]。這3個(gè)mtDNA序列都存在許多變異位點(diǎn)（見(jiàn)表3）：D-Loop區(qū)的19個(gè)已報(bào)道的多態(tài)性位點(diǎn)，無(wú)功能意義；12S rRNA基因區(qū)3個(gè)，16S rRNA基因區(qū)3個(gè)， 以及tRNAThr15930G＞A和tRNAPhe596T＞C突變，均為報(bào)道過(guò)的多態(tài)性位點(diǎn)；在13個(gè)多肽編碼區(qū)存在37個(gè)突變位點(diǎn)，包括同義突變25個(gè)，錯(cuò)義突變12個(gè)（http://www.mitomap.org or http://www.genpat.uu.se/mtDB）。這些錯(cuò)義突變分別為：ND1基因3394T＞C（30Y＞H），ND2基因5263C＞T（265A＞V），ATP6基因8584G＞A（20A＞T）、8701A＞G（59T＞A）、8860A＞G（112T＞A），ND3基因10398A＞G（114T＞A），ND5基因12361A＞G（9T＞A）、12362C＞T（9T＞A）和13942A＞G（536T＞A），Cytb基因14766C＞T（7I ＞T）、15308A＞G（98I＞V）、15326A＞G（194T＞A）。將上述位點(diǎn)進(jìn)行17個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)物種保守性分析，發(fā)現(xiàn)除ND1基因3394位點(diǎn)外，其余位點(diǎn)均不保守。將以上位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析，WHP12、WHP13、WHP14家系分別屬于東亞線(xiàn)粒體單體型Z3、Z3和B4d[19]。

表1 3個(gè)家系先證者臨床資料匯總

表2 3個(gè)家系成員臨床資料匯總

WHP13家系先證者I I-2攜帶的同質(zhì)性ND1 3394T ＞C突變?cè)?7個(gè)物種進(jìn)化上高度保守，使ND1第30位氨基酸由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸，有報(bào)道顯示其與多種疾病相關(guān)[22]。家系分析發(fā)現(xiàn)WHP13家系母系成員EH發(fā)病率遠(yuǎn)高于另外2個(gè)家系，且臨床特征較另外2個(gè)家系有所不同，因此ND1 3394T＞C突變可能與tRNAGln4363T＞C突變共同作用影響該家系EH表型的表達(dá)。

線(xiàn)粒體tRNAGln為重鏈編碼tRNA，4363T相對(duì)應(yīng)于tRNAGln二級(jí)結(jié)構(gòu)反密碼子環(huán)的A38位置，其在17種靈長(zhǎng)類(lèi)及鼠[23]、牛[24]和爪蟾等20個(gè)物種中是高度保守的。Wong等[25]在發(fā)育遲緩、胃腸反流、視網(wǎng) 膜炎發(fā)育不良和感音神經(jīng)性耳聾女性?xún)和颊咧邪l(fā)現(xiàn)了此突變，并證實(shí)4363T＞C是一個(gè)同質(zhì)性突變。本研究在3個(gè)EH家系中都發(fā)現(xiàn)了此突變，提示tRNAGln4363T＞C突變可能與EH相關(guān)。目前報(bào)道的發(fā)生在線(xiàn)粒體tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)38位上的致病性突變包括tRNAAsn5692A＞G[26]、tRNASer（UCN）7480A＞G[27]和tRNAThr15923A＞G[28]突變等。tRNA 38位置是反密碼子環(huán)鄰近反密碼子莖的最后一個(gè)堿基。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中上述致病性突變通過(guò)與相對(duì)應(yīng)的32位形成W-C堿基配對(duì)，延長(zhǎng)反密碼子莖縮小反密碼子環(huán)，破壞tRNA合成酶識(shí)別和密碼子的配對(duì)，造成tRNA功能障礙，降低線(xiàn)粒體蛋白合成率引起線(xiàn)粒體功能障礙，引起疾病產(chǎn)生。tRNAGln4363T＞C突變可能對(duì)反密碼子識(shí)別的高保真性產(chǎn)生影響，從而參與疾病的發(fā)生。

圖1 3個(gè)攜帶tRNAGln4363T＞C突變家系圖（黑色填充表示EH患者，箭頭所指為先證者）

圖2 tRNAGln4363T＞C突變鑒定

表3 3個(gè)先證者線(xiàn)粒體基因全序分析表

續(xù)表3

續(xù)表3

3 討論

通過(guò)家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些患者的生活環(huán)境和生活方式不同，沒(méi)有血緣關(guān)系，卻有EH這一唯一共同的臨床特征。EH發(fā)病年齡和病情嚴(yán)重程度在各家系 及家系成員間存在差別，母系成員的發(fā)病年齡從27 到64歲不等，平均發(fā)病年齡為44歲。3個(gè)家系的EH發(fā) 病具有以下特征：①外顯率：WHP12、WHP13和WHP14 家系母系成員的外顯率分別為33.3%、63.6%和30%。WHP13家系外顯率明顯高于WHP12和WHP14。②發(fā)病年齡：WHP12家系第I I I代無(wú)母系成員，第I I代母系成員的平均發(fā)病年齡為64歲。WHP13家系中第I I、第I I I代母系成員的平均發(fā)病年齡為40和27歲，平均發(fā)病年齡為33.5歲，第I I I代發(fā)病年齡明顯提前，低于平均發(fā)病年齡。WHP14家系中第I、I I代發(fā)病年齡分別為40和44歲，第I I I代均未發(fā)病。③血壓情況：3個(gè)家系的平均血壓值分別為162.5/83 mmHg、152.5/84 mmHg和145/97.5 mmHg，血壓嚴(yán)重情況在3個(gè)家系間差異不明顯。

EH在這3個(gè)家系中呈母系遺傳，且分子遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)他們擁有一個(gè)共同的分子基礎(chǔ)即mtDNA tRNAGln4363T＞C突變。此突變?cè)?54例正常對(duì)照者中出現(xiàn)的頻率為0，在17個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)物種中的保守性指數(shù)為76.5%，而且位于tRNAGln高度保守的位置上，表明線(xiàn)粒體tRNAGln4363T＞C突變可能是這3個(gè)母系遺傳EH家系發(fā)病的主要分子基礎(chǔ)。與其他與高血壓相關(guān)的mtDNA突變一樣，tRNAGln4363T＞C也是同質(zhì)性突變，該突變位于tRNAGln二級(jí)結(jié)構(gòu)反密碼子環(huán)的A38位置，可能影響線(xiàn)粒體tRNA的結(jié)構(gòu)和功能，

導(dǎo)致輕度的線(xiàn)粒體功能缺陷，進(jìn)而引發(fā)疾病的產(chǎn)生。WHP13家系母系成員EH發(fā)病率遠(yuǎn)高于另外2個(gè)家系，且臨床特征較另外2個(gè)家系有所不同，推測(cè)線(xiàn)粒體ND1 3394T＞C突變可能與tRNAGln4363T＞C突變共同作用影響該家系EH表型的表達(dá)。而3個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNAGln4363T＞C突變的EH家系表現(xiàn)出的同質(zhì)性突變、發(fā)病年齡及外顯率不同等表型差異特征提示核修飾基因、環(huán)境因素和線(xiàn)粒體遺傳背景等可能對(duì)tRNAGln4363T＞C突變家系EH的表型表達(dá)有一定的影響[29] 。

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（本文編輯：吳健敏）

The genetic analysis of mitochondrial tRNAGln4363 T ＞ C mutation associated with essential hypertension in three Chinese Han pedigrees

YU Han1,GENG Junwei1,LIN Zhi1,XUE Ling1,TANG Xiaowen1,ZHENG Binjiao1,LV Jianxin1,LU Zhongqiu1,GUAN Minxin1,3.
1.Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Institute of Genetics,Zhejiang University,Hangzhou,310058

Objective:To analyze and evaluate the clinical,genetic and molecular characteristics of mtDNA in three Han Chinese pedigrees with essential hypertension and explore the role of tRNAGln4363T＞C mutation in the development of those maternally inherited essential hypertension.Method:Mitochondrial tRNA gene of 848 Chinese Han essential hypertension subjects and 254 control subjects were amplified with PCR.Members of 3 Chinese Han pedigrees with mitochondrial tRNAGln4363T＞C mutation underwent mitochondrial DNA genetic analysis and pedigree assessment.Result:Three essential hypertension subjects were found with tRNAGln4363T＞C mutation,and with variable severity and age-of-onset in hypertension among the three pedigrees.The percentage of this mutation was 0.35%.Twelve of 28 matrilineal relatives in these families exhibited the variable degree of hypertension at the age at onset of 27 to 64 years old and at the average of 44 years old,while none of the offspring at affected father had hypertension.Sequence analysis of complete mitochondrial genomes in 3 pedigrees showed that,in addition to the homoplasmic 4363T＞C mutation,there were also 64 other mutations,and the mtDNA polymorphisms belonged to haplogroups Z3,Z3 and B4d,respectively.The tRNAGln4363T was localized at immediately 3’end to the anticodon,corresponding to highly conserved adenine at position 38 of tRNAGln,the4363C＞T mutation might affect the high fidelity of recognition and the formation and stability of normal tRNA structure.Conclusion:The occurrence of the tRNAGln4363T＞C mutation in three genetically unrelated pedigrees affected by hypertension and the absence in 254 Chinese controls strongly indicate that this mutation is associated with essential hypertension.The homoplasmic form,late onset and incomplete penetrance of hypertension observed in those Chinese pedigrees suggest that tRNAGln4363T＞C mutation may be insufficient to produce a clinical phenotype,nuclear modifier gene (s) or environmental factor (s) may play a role in the phenotypic expression of essential hypertension related to tRNAGln4363T＞C mutation.

essential hypertension; mitochondrial DNA; tRNAGln; gene mutations; Han pedigress

R544.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.001

2014-11-26

國(guó)家青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31401070，31100903）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110399）；浙江省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（Y2009A135）；溫州醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展基金資助項(xiàng)目（QTJ13017）。

于涵（1992-），女，黑龍江綏化人，碩士生。

管敏鑫，教授，博士生導(dǎo)師，Email：gminxin88@zju.edu.cn。