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        羅紅霉素對(duì)離體哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

        2015-12-27 07:16:26吳海亞戴元榮應(yīng)斌宇

        吳海亞,戴元榮,應(yīng)斌宇

        (溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,浙江 溫州 325027,1.重癥醫(yī)學(xué)科;2.呼吸內(nèi)科)

        ·論 著·

        羅紅霉素對(duì)離體哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

        吳海亞1,戴元榮2,應(yīng)斌宇1

        (溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,浙江 溫州 325027,1.重癥醫(yī)學(xué)科;2.呼吸內(nèi)科)

        目的:觀察羅紅霉素對(duì)離體氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)凋亡的影響以及線粒體凋亡途徑在ASMCs凋亡中的作用。方法:體外培養(yǎng)哮喘大鼠ASMCs,用不同濃度(0、10、25、50、100μg/mL分別對(duì)應(yīng)R0組、R10組、R25組、R50組、R100組)的羅紅霉素干預(yù)48 h。Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡;JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體跨膜電位(ΔΨm)的變化;Western blot法分析線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C(Cyt-c)的含量。結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組(R10組、R25組、R50組、R100組)ASMCs的早期凋亡率分別為(4.6±1.9)%、(5.8±2.9)%、12.0±5.6)%、(26.9±11.1)%,較R0組的(2.9±1.7)%高,其中R100組與R0組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=13.30,P<0.01)。各實(shí)驗(yàn)組(R10組、R25組、R50組、R100組)低ΔΨm細(xì)胞所占比例分別為(27.88±13.10)%、40.35±9.19)%、(48.40±14.15)%、(52.90±15.88)%,較R0組的(19.78±9.85)%高,其中R100組和R50組ΔΨm顯著低于R0組和R10組(P<0.05或0.01),R25組與R0組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),R10組與R0組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);各實(shí)驗(yàn)組(R10組、R25組、R50組、R100組)胞漿Cyt-c的含量分別為(0.87±0.19)、(0.97±0.17)、(1.01±0.12)、(1.14±0.07),較R0組的(0.67±0.12)高,R100組與R0組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.075,P<0.05)。結(jié)論:羅紅霉素可以通過(guò)激活線粒體凋亡通路促進(jìn)離體ASMCs的凋亡。

        羅紅霉素;哮喘;氣道重塑;平滑肌細(xì)胞;凋亡

        上世紀(jì)50年代人們就發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除抗感染作用外還有較強(qiáng)的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)作用,其對(duì)彌漫性泛細(xì)支氣管炎(diffuse pan-bronchiolitis,DPB)具有確切的療效[1]。此后,人們開始探索大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)其他慢性炎癥性疾?。ㄈ缦?、囊性纖維化等)的治療作用。羅紅霉素是新一類的半合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,可以降低氣道高反應(yīng)性[2],改善哮喘患者的癥狀和肺功能[3]。Tada等[4]發(fā)現(xiàn)羅紅霉素可以抑制慢性哮喘豚鼠氣道重塑的發(fā)生。有文獻(xiàn)報(bào)道,羅紅霉素可以抑制人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖[5],阿奇霉素可以促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)的凋亡[6-7]。本課題組早期在體實(shí)驗(yàn)顯示羅紅霉索可部分通過(guò)促進(jìn)ASMCs凋亡抑制氣道平滑肌增厚,其促進(jìn)ASMC凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)P27表達(dá)及激活線粒體凋亡通路有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)以離體哮喘大鼠ASMCs作為研究對(duì)象,觀察羅紅霉素的干預(yù)作用,并進(jìn)一步探討線粒體凋亡通路在ASMCs凋亡中的作用。

        1 材料和方法

        1.1 材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠20只,體質(zhì)量120~140 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;SM α-actin單克隆抗體(Sigma,USA);小鼠免疫組織化學(xué)試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone,USA);優(yōu)級(jí)胎牛血清(杭州四季青公司);羅紅霉素(Sigma,USA);JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(Pierce,USA);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、小鼠源性α-Tubulin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(江蘇碧云天生物工程有限公司);Annexin VFITC/PI KIT(Biovision,USA);Agarose(Biowest,Spain);小鼠源性細(xì)胞色素C(cytochrome c,Cytc)單克隆抗體、兔源性VDAC1/Porin多克隆抗體(Abcam,USA)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 ASMCs的體外培養(yǎng)及鑒定:SPF級(jí)雄性SD大鼠20只,參照Palmans等[9]的方法復(fù)制慢性哮喘模型。模型建立后,分離大鼠支氣管樹,采用改良組織貼塊法[10]培養(yǎng)原代ASMCs,采用差速貼壁法純化細(xì)胞[11]。SM α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定平滑肌細(xì)胞。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:取第3~第8代培養(yǎng)的細(xì)胞,隨機(jī)分為R0組(不予羅紅霉素)和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(即R10組、R25組、R50組、R100組,羅紅霉素終濃度分別為10、25、50、100μg/mL)。用含不同濃度羅紅霉素的完全培養(yǎng)基(含10% FBS)培養(yǎng)48 h后,換無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后收集細(xì)胞檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

        1.2.3 Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞:收集約2×105個(gè)細(xì)胞及舊培養(yǎng)基,按照Annexin V-FITC/PI KIT說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

        1.2.4 JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位(Δ Ψm):收集2×105個(gè)細(xì)胞,按照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

        1.2.5 Western blot法檢測(cè)胞漿內(nèi)及線粒體內(nèi)Cyt-c的蛋白水平:收集約5×107個(gè)細(xì)胞,按Pierce線粒體分離試劑盒抽提線粒體和胞漿蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。以每泳道50μg蛋白的量進(jìn)行定量分析,化學(xué)發(fā)光法顯示印跡條帶,分別測(cè)定胞漿和線粒體Cyt-c的表達(dá)。胞漿Cyt-c以α-Tubulin為內(nèi)參,線粒體Cyt-c以VDAC1/Porin為內(nèi)參。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,以±s表示。正態(tài)分布資料的組間差異比較采用單因素方差分析,方差齊性者采用LSD法,方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn);非正態(tài)分布資料的組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 離體培養(yǎng)的ASMCs的鑒定 取第3代培養(yǎng)細(xì)胞制成細(xì)胞爬片,對(duì)平滑肌細(xì)胞特異的α-actin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)SP法染色,顯微鏡觀察,95%以上細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性染色,胞漿呈棕黃色,胞核呈紫藍(lán)色(見圖1),證實(shí)為平滑肌細(xì)胞[11]。

        2.2 細(xì)胞形態(tài)的變化情況 羅紅霉素干預(yù)48 h后,倒置顯微鏡下觀察,可見R100組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變,絕大多數(shù)細(xì)胞收縮、變小,胞漿空泡化,顆粒物增多,部分細(xì)胞脫壁,符合凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變[6,12];R50組和R25組可見少數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈前述改變;R0組和R10組細(xì)胞倒置顯微鏡下觀察未見明顯形態(tài)改變。見圖2。

        圖1 抗SMα-actin免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定ASMCs(×400)

        2.3 細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)組(R10組、R25組、R50組、R100組)ASMCs的早期凋亡率分別為(4.6±1.9)%、(5.8±2.9)%、(12.0±5.6)%、(26.9±11.1)%,較R0組的(2.9±1.7)%高。Nemenyi法檢驗(yàn)結(jié)果顯示,R100組與R0組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=13.30,P <0.01)。

        2.4 線粒體ΔΨm變化情況 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ΔΨm較R0組降低,且隨著藥物濃度的增加,ΔΨm降低越顯著。LSD檢驗(yàn)結(jié)果顯示R100組和R50組顯著低于R0組和R10組(P<0.05或0.01);R25組與R0組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而R10組與R0組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

        圖2 倒置顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)(×200)

        表1 各組細(xì)胞線粒體ΔΨm比較(n=4,±s)

        表1 各組細(xì)胞線粒體ΔΨm比較(n=4,±s)

        與R0組比:aP<0.05,bP<0.01;與R10組比:cP<0.05,dP<0.01

        組別 低ΔΨm細(xì)胞比率(%)R0組 19.78±9.85 R10組 27.88±13.10 R25組 40.35±9.19aR50組 48.40±14.15bcR100組 52.90±15.88bd

        2.5 線粒體Cyt-c的釋放情況 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞漿內(nèi)Cyt-c的含量較R0組高,且隨藥物濃度的增高而增高,而線粒體內(nèi)Cyt-c的含量較R0組降低,且隨藥物濃度的增高,降低越顯著。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果為x2=11.167,P=0.025。采用Nemenyi法進(jìn)行組間兩兩比較,發(fā)現(xiàn)R100組與R0組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.075,P<0.05)。詳見圖3和表2。

        圖3 羅紅霉素對(duì)ASMCs線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)Cyt-c的影響

        3 討論

        ASMCs增生和肥大直接導(dǎo)致氣道壁增厚。此外,ASMCs能合成和分泌促炎癥因子、黏附因子、趨化因子等,使氣道炎癥持續(xù)存在[13]。Johnson等[14]觀察離體培養(yǎng)的ASMCs(來(lái)自肺部手術(shù)標(biāo)本)的生物學(xué)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn),來(lái)自哮喘患者和無(wú)氣道疾病患者的ASMCs在體外培養(yǎng)時(shí),雖然細(xì)胞的形態(tài)相似,但前者增殖明顯快于后者,說(shuō)明離體培養(yǎng)的ASMCs保留或部分保留原有的生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)所采用的ASMCs來(lái)自慢性哮喘大鼠氣道重塑模型,旨在模擬病理狀態(tài)下的細(xì)胞生物學(xué)特性,使得研究結(jié)果更具臨床指導(dǎo)意義。

        表2 胞漿和線粒體Cyt-c含量的比較(n=3,±s)

        表2 胞漿和線粒體Cyt-c含量的比較(n=3,±s)

        與R0組比:P<0.05

        組別 胞漿 線粒體R0組 0.67±0.12 1.01±0.03 R10組 0.87±0.19 0.97±0.01 R25組 0.97±0.17 0.92±0.08 R50組 1.01±0.12 0.78±0.13 R100組 1.14±0.07a 0.65±0.12a

        磷酯酰絲氨酸(phospholipid phosphatidylserine,PS)主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期,雖然細(xì)胞膜尚完整,但PS會(huì)外翻到細(xì)胞膜外側(cè)[15],通過(guò)熒光探針標(biāo)記的Annexin V與之結(jié)合能檢測(cè)到PS的外翻[16]。而壞死或凋亡晚期細(xì)胞,由于細(xì)胞膜的完整性喪失,Annexin V能與PS結(jié)合,但同時(shí)細(xì)胞核會(huì)被碘化丙啶(PI)著色[16]。這樣可以將凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和正?;罴?xì)胞區(qū)別開來(lái)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC(+)和PI(-)細(xì)胞群所占比率(即早期凋亡率),R0組為(2.9±1.7)%,而4個(gè)實(shí)驗(yàn)組按羅紅霉素濃度從低到高分別為(4.6±1.9)%、(5.8±2.9)%、(12.0±5.6)%、(26.9±11.1)%,均高于R0組,證實(shí)了羅紅霉素能夠誘導(dǎo)ASMCs發(fā)生凋亡,且呈量效關(guān)系,與倒置顯微鏡下所見細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相一致。

        線粒體凋亡通路以線粒體ΔΨm下降和線粒體釋放Cyt-c入胞漿為主要特征[17]。目前認(rèn)為,線粒體釋放Cyt-c入胞漿是線粒體凋亡通路的標(biāo)志性事件[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離線粒體和胞漿蛋白,使用蛋白印跡分別對(duì)其Cyt-c的含量進(jìn)行半定量測(cè)定,結(jié)果表明,各實(shí)驗(yàn)組胞漿內(nèi)Cyt-c含量較R0組增多,而對(duì)應(yīng)的線粒體內(nèi)Cyt-c含量較R0組降低,且呈量效關(guān)系,提示羅紅霉素呈濃度依賴性地促進(jìn)線粒體釋放Cyt-c入胞漿,與吳斌等[8]的研究結(jié)果一致。線粒體ΔΨm的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件,它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前[19]。線粒體ΔΨm的下降一旦進(jìn)入不可逆過(guò)程,則引起線粒體膨脹及外膜的破裂,各種凋亡因子會(huì)通過(guò)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pole,MPTP)或破裂的外膜直接泄漏入胞漿,而致細(xì)胞凋亡發(fā)生[20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)JC-1染色檢測(cè)線粒體ΔΨm的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組低ΔΨm細(xì)胞的比率較R0組增高,而高Δ Ψm細(xì)胞的比率較R0組減少,說(shuō)明在羅紅霉素作用下,ASMCs的線粒體ΔΨm降低,與線粒體Cyt-c釋放結(jié)果一致。當(dāng)羅紅霉素濃度≥25μg/mL時(shí),能引起線粒體ΔΨm顯著下降(P<0.05或0.01)。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)羅紅霉素濃度達(dá)到150 μg/mL時(shí),倒置顯微鏡下可見絕大多數(shù)細(xì)胞脫壁、腫脹、破碎,呈現(xiàn)出壞死征象,而當(dāng)羅紅霉素濃度為100μg/mL時(shí)并未見明顯細(xì)胞壞死征象,提示25~100μg/mL可能為有效的藥物組織濃度。

        綜上所述,羅紅霉素能激活線粒體凋亡通路,且呈濃度依賴性,從而促進(jìn)離體哮喘大鼠ASMCs發(fā)生早期凋亡。

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        (本文編輯:丁敏嬌)

        The effect and the mechanism of Roxithromycin on apoptosis of airway smooth muscle cells from asth- matic rats in vitro

        WU Haiya1,DAI Yuanrong2,YING Binyu1.1.Intensive Care Unit,the Second AffiliatedHospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027; 2.Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

        Objective:To observe the effects of Roxithromycin on apoptosis of airway smooth muscle cells ASMCs) in vitro and the role of mitochondrial pathway in apoptosis of ASMCs.Methods:ASMCs from asthmatic rats were cultured in vitro and intervened with various concentrations of Roxithromycin for 48 hours.Early apoptotic cells were detected through flow cytometry (FCM) after stained with Annexin V/PI; Alteration of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was also examined by FCM after stained with JC-1; Cytochrome C (Cyt-c) both in mitochondria and cytoplasm was analyzed by Western Blot.Results:Roxithromycin could induce the apoptotic death of ASMCs in vitro:Early apoptotic rate in experimental group (R10,R25,R50,R100) after 48 h intervention was (4.6±1.9)%,(5.8±2.9)%,(12.0±5.6)% and (26.9±11.1)%,respectively,compared to control 2.9±1.7)%.And there was a significant difference (x2=13.30,P<0.01) between the group R100 and the control.RXM induced loss of ΔΨm:The proportion of low ΔΨm cells of the experimental group (R10,R25,R50,R100) was (27.88±13.10)%,(40.35±9.19)%,(48.40±14.15)% and (52.90±15.88)%,respectively,compared to the conrol group (19.78±9.85)%.The indexes of group R100 and R50 were significantly lower than that of group R0 and R10 (P<0.05 or 0.01).The difference between group R25 and R0 was also statistically significance (P<0.05).But there was no statistical difference between group R10 and R0.Roxithromycin could induce Cyt-c release rom mitochondria into the cytosol:The content of cytosolic Cyt-c in group R10,R25,R50,R100 was respecively (0.87±0.19),(0.97±0.17),(1.01±0.12),(1.14±0.07),higher than that in the control group (0.67±0.12).Therewas a significant difference between the group R100 and R0 (x2=9.075,P<0.05).Conclusion:Roxithromycin can induce apoptosis of ASMCs in vitro via activating mitochondrial pathway.

        Roxithromycin; asthma; airway remodeling; smooth muscle cells; apoptosis

        R562.2

        A

        10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.005

        2014-08-07

        浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y2080466);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009A144)。

        吳海亞(1981-),女,浙江永嘉人,主治醫(yī)師,碩士。

        戴元榮,教授,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,Email:daiyr@126.com。

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