李劍敏，吳玲，張迪，鄭靖宇，戴爽，袁風菊，吳歡，彭天慶

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

銀杏葉提取物對高糖環(huán)境中心肌細胞凋亡及Drp-1、Mfn-2表達的影響及其可能機制

李劍敏，吳玲，張迪，鄭靖宇，戴爽，袁風菊，吳歡，彭天慶

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015）

目的：探討銀杏葉提取物（EGB）對高糖環(huán)境中新生大鼠心肌細胞凋亡和線粒體凋亡途徑中線粒體分裂蛋白1（Drp-1）、融合蛋白2（Mfn-2）、Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響。方法：體外分離SD乳鼠心肌細胞，分別用低糖（LG組）、低糖+EGB（LG+EGB組）、高糖（HG組）和高糖+EGB（HG+EGB組）培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞。分別用流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡率，用Western blot和/或RT-PCR分別檢測心肌細胞Drp-1、Mfn-2、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達。結(jié)果：與LG組相比，HG組心肌細胞凋亡率、Drp-1、Bax、Caspase-3表達和Bax/Bcl-2比值均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Bcl-2、Mfn-2表達均降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與HG組相比，HG+EGB組心肌細胞凋亡率、Drp-1表達、Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2比值均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Bcl-2表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但Mfn-2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：EGB通過上調(diào)高糖環(huán)境中心肌細胞Bcl-2的表達，同時下調(diào)Drp-1、Bax和Caspase-3的表達，從而減少心肌細胞的凋亡。這可能是EGB防治糖尿病心肌病的機制之一。

糖尿??；銀杏葉提取物；心肌細胞；線粒體；凋亡

銀杏葉提取物（extract gingko biloba，EGB）主要成分是黃酮類和萜類內(nèi)酯化合物，其中黃酮類甙已被證實是一類抗氧化劑。近年來，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌細胞通過脂質(zhì)代謝、葡萄糖自身氧化等多種途徑在線粒體內(nèi)產(chǎn)生更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[1]，并證實是調(diào)控凋亡的關(guān)鍵因素，引起線粒體途徑的凋亡[2]。新近的大量研究顯示，線粒體分裂/融合蛋白（Drp-1/Mfn-2）不僅控制線粒體的形態(tài)和功能，還參與細胞線粒體途徑的凋亡過程[3]。那么，在糖尿病高糖環(huán)境中心肌細胞線粒體的分裂/融合是否參與心肌細胞的凋亡，目前文獻報道甚少。本研究為排除EGB在機體內(nèi)藥物代謝各個環(huán)節(jié)對糖尿病機體的影響，通過體外分離、培養(yǎng)新生SD大鼠左心室心肌細胞，用高糖培養(yǎng)基模擬I型糖尿病的機體環(huán)境，并用EGB干預(yù)，觀察高糖環(huán)境中心肌細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)基因的表達，以期闡明EGB對糖尿病心肌病的保護機制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑和藥物 EGB（北京雙鶴高科天然藥物有限公司，批號為100718）；FITC-Annexin V/ PI細胞凋亡試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、D-Hanks液、胎牛血清（GIBCO公司）；Western blot化學發(fā)光免疫印跡法細胞凋亡相關(guān)蛋白I抗、Ⅱ抗（碧云天生物技術(shù)研究所）；RT-PCR引物合成（上海生工生物工程有限公司）；Trizol（Invitrogen life technologies）；化學發(fā)光試劑盒（Biological Industries）；MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Ultralum公司）；UV-754型紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司）；流式細胞儀（FACScan型美國BD公司）。

1.2 心肌細胞的分離和培養(yǎng) 取SPF級健康SD出生1～2 d的乳鼠10只，用75%乙醇消毒皮膚，開胸取心臟，用無菌紗布吸干血液并剪取左心室，用預(yù)冷的50 mL D-Hanks液沖洗1次，用眼科剪碎心臟組織，再用50 mL D-Hanks液沖洗3次；去沖洗液后加0.0225 mg/mL Liberase TH的D-Hanks液3 mL，置37 ℃水浴，10 min，期間每2～3 min吹打3～5次；靜置1～2 min后收集上清液到15 mL離心管，4 ℃離心（200 g 5 min）；去上清液后，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM（含5.5 mmol葡萄糖）培養(yǎng)液3 mL，懸起心肌細胞以終止消化。同上述的方法再分離心肌組織1次，共收集心肌細胞懸液6 mL。將6 mL心肌細胞懸液移至60 mm的培養(yǎng)皿，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，90 min后，去掉大塊的雜質(zhì)和貼壁的成纖維細胞，將心肌細胞轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管，懸勻并調(diào)節(jié)心肌細胞密度，以5×105/mL的細胞密度直接接種到用1%明膠處理過的12孔培養(yǎng)板。繼續(xù)置入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)心肌細胞，24 h后更換培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液），24 h后待細胞搏動良好后，開始分組實驗。

1.3 實驗分組 流式細胞凋亡率檢測實驗設(shè)低糖組（LG組）、低糖組+EGB組（LG+EGB組）、高糖組（HG組）和高糖+EGB組（HG+EGB組），每組3孔。其他實驗則僅設(shè)LG組、HG組和HG+EGB組，每組4孔。LG組和HG組分別用1%雙抗+10%胎牛血清+低糖DMEM（含5.5 mmol葡萄糖）和1%雙抗+10%胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)液（含25 mmol葡萄糖），LG+EGB組和HG+EGB組則分別用1%雙抗+10%胎牛血清+低糖DMEM培養(yǎng)液+EGB和1%雙抗+10%胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)液+EGB。EGB終末濃度為100 μg/mL。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.4 方法

1.4.1 細胞凋亡率檢測：用0.125%胰酶消化，預(yù)冷的PBS洗3次，Binding Buffer重懸細胞，200目篩網(wǎng)過篩，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，檢測前30 min加入FITC-Annexin V，低溫避光孵育，檢測前5 min加入PI。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4.2 Western blot法檢測心肌細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達：根據(jù)上述1.3實驗分組，收獲各組心肌細胞。用蛋白裂解液充分裂解心肌細胞，置4 ℃離心（14 000 r/min，10 min），取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白含量。樣品加熱變性后加樣，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉，TBS-T洗膜，I抗結(jié)合，4 ℃過夜，Ⅱ抗室溫輕搖1 h后，再洗膜后加化學發(fā)光液，膠片感光成像。用計算機分析軟件進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶累積吸光度（A）比作為反映目的蛋白表達水平的相對指標。所用I抗?jié)舛龋築cl-2 1∶250，Bax 1∶400，Caspase-3 1∶600；Ⅱ抗?jié)舛龋?∶5 000。

1.4.3 RT-PCR技術(shù)檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、Drp-1和Mfn-2的mRNA的表達：如上述收獲心肌細胞，按Trizol試劑說明書方法提取心肌細胞總RNA。取1 μg進行RT-PCR反應(yīng)。Bcl-2上游引物5’-CTGGTGG ACAACATCGCTCTG-3’，下游引物5’-GGTCTGCTGACCTC ACTTGTG-3’，產(chǎn)物228 bp；Bax上游引物5’-GCGA ATTGGAGATGAACTGG-3’，下游引物5’-GTGAGCGAGGC GGTGAGGAC-3’，產(chǎn)物366 bp；Caspase-3上游引物5’-GAAGCGAATCAATGGACTCTG-3’，下游引物5’-GCACAA AGCGACTGGATGAA-3’，產(chǎn)物595 bp；Drp-1上游引物5’-CGTAGTGGGAACTCAGAGCA-3’，下游引物5’-TGGA CCAGCTGCAGAATAAG-3’，產(chǎn)物120 bp；Mfn-2上游引物5’-CTCAGGAGCGGGTTTATTGTCT-3’，下游引物5’-TGTCGAGGGACCAGCATGTCTATCT-3’，產(chǎn)物412 bp；β-actin（內(nèi)參1）上游引物5’-CATCTCTTGCTCGAAG TCCA-3’，下游引物5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，產(chǎn)物318 bp；β-actin（內(nèi)參2）上游引物5’-GATGG TGGGTATGGGTCAGAA-3’，下游引物5’-GGCCATCTCTTG CTCGAAGTC-3’，產(chǎn)物630 bp；PCR變性、退火和延伸溫度分別為94 ℃、55 ℃和72 ℃，反應(yīng)時間分別為30 s、30 s和60 s，共進行38個循環(huán)。循環(huán)完畢再72 ℃延伸10 min，4 ℃ 60 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片，然后用MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)對每一標本的PCR產(chǎn)物擴增的特異性片段進行灰度掃描，以β-actin密度作為參考定量標準，數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。多組比較用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗，所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 LG組與LG+EGB組均有少量細胞凋亡，2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HG組分別與LG組和LG+EGB組比較，細胞凋亡明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；HG+EGB組較HG組細胞凋亡減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示高糖可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，EGB干預(yù)則減少高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，見表1、圖1。

表1 EGB對高糖環(huán)境中心肌細胞凋亡的影響（n=3，±s）

圖1 流式細胞檢測結(jié)果

2.2 EGB對高糖環(huán)境中心肌細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 與LG組相比，HG組心肌細胞Bax、Caspase-3蛋白的表達、Bax/Bcl-2比值均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），而Bcl-2表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與HG組相比，HG+EGB組心肌細胞Bax、Caspase-3蛋白的表達、Bax/Bcl-2比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），而Bcl-2明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 Western blot法測定結(jié)果（n=3，±s）

2.3 EGB對高糖環(huán)境中心肌細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Drp-1和Mfn-2 mRNA表達的影響 與LG組相比，HG組心肌細胞的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、Drp-1 mRNA的表達以及Bax/Bcl-2比值均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），而Bcl-2 mRNA、Mfn-2 mRNA的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與HG組相比，HG+EGB組心肌細胞的Bcl-2 mRNA的表達明顯升高，而Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、Drp-1 mRNA的表達以及Bax/Bcl-2比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），而Mfn-2的mRNA表達卻沒有明顯的升高（P＞0.05），見圖3-4。

圖3 各組心肌細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的RT-PCR分析結(jié)果（n=3，±s）

圖4 各組心肌細胞Drp-1和Mnf-2 mRNA的RT-PCR分析結(jié)果（n=3，±s）

3 討論

本研究在體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞以模擬1型糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)HG組心肌細胞的凋亡率明顯高于HG+EGB組，提示EGB能通過減少心肌細胞的凋亡保護高糖環(huán)境中的心肌細胞。目前，線粒體凋亡通路的激活被認為在糖尿病心肌細胞凋亡的過程中起著主開關(guān)作用，而且是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，其機制涉及一系列的基因調(diào)控。Bcl-2家族是目前公認的通過線粒體信號通路來早期調(diào)控凋亡的重要基因。該家族包括抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL和促凋亡的Bax成員。Bcl-2基因表達的蛋白位于線粒體外膜上，而Bax基因表達的蛋白則散布于胞質(zhì)中。在ROS等各種凋亡信號刺激下，Bax從細胞質(zhì)遷移到線粒體外膜上，形成Bax/Bcl-2同源二聚體，Bcl-2可使Bax蛋白失活，但Bax表達過多則促進凋亡的發(fā)生，而Bcl-2表達增加則可減少或抑制細胞的凋亡。因此，在凋亡早期，Bax/Bcl-2的比值升高與否是決定細胞線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下行的重要因素[4]。本實驗高糖模擬1型糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)心肌細胞的Bax表達增加，Bcl-2的表達降低，從而Bax/Bcl-2的比值升高，則促進心肌細胞線粒體途徑的早期凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下行；而EGB通過減少心肌細胞Bax的表達，增加Bcl-2的表達，降低Bax/Bcl-2的比值，提示EGB可抑制心肌細胞線粒體途徑的早期凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下行。

近幾年來，研究發(fā)現(xiàn)Drp-1/Mfn-2同樣屬于凋亡早期改變的蛋白，而且位于Bax的下游[3，5]。Drp-1是一個與發(fā)動蛋白相關(guān)的蛋白，在哺乳動物細胞中，Drp-1是線粒體分裂相關(guān)的主要蛋白之一。該蛋白在正常的細胞內(nèi)大部分分布于胞漿中，少部分聚合在線粒體即將分裂的外膜上。與分裂蛋白相反，Mfn-2主要分布在線粒體外膜上，是與線粒體融合有關(guān)的主要蛋白之一。雖然在細胞凋亡的過程中Bax與Drp-1和Mfn-2均共定位于線粒體即將分裂的部位[5-6]，但Lee等[5]進一步的研究發(fā)現(xiàn)Drp-1作用位于Bax轉(zhuǎn)位的下游，即抑制Drp-1的表達可抑制細胞凋亡，并不影響B(tài)ax從細胞漿到線粒體外膜的轉(zhuǎn)位；反之，增加Drp-1的表達則可促進線粒體的分裂增加，導(dǎo)致心肌細胞凋亡的發(fā)生，而抑制Mfn-2則增加細胞對凋亡信號的敏感性，甚至導(dǎo)致自發(fā)性的細胞凋亡[7]。另外，Yu等[8]用高糖培養(yǎng)不同動物的心肌細胞，發(fā)現(xiàn)心肌細胞ROS活性增高，線粒體分裂蛋白Drp-1過表達導(dǎo)致線粒體分裂增加，細胞凋亡發(fā)生。本實驗觀測高糖環(huán)境中心肌細胞的Drp-1和Mfn-2的基因表達，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境中心肌細胞Drp-1的基因呈高表達，而Mfn-2的基因呈低表達。EGB可減少高糖環(huán)境中心肌細胞的Drp-1的基因表達，但并沒有增加Mfn-2的基因表達。提示高糖環(huán)境中心肌細胞凋亡與心肌細胞的線粒體分裂和融合蛋白的基因表達的改變有關(guān)。EGB保護心肌細胞可能是通過調(diào)節(jié)線粒體分裂表達，上調(diào)Drp-1/Mfn-2比值有關(guān)。

事實上，Brooks等[9]進一步研究發(fā)現(xiàn)在細胞應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體的分裂蛋白表達增加，線粒體融合蛋白表達減少，Drp-1/Mfn-2比值增加致使細胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變，尤其是線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔（mPTP）高水平開放，線粒體內(nèi)Cyt-c、凋亡誘導(dǎo)因子等一系列凋亡效應(yīng)蛋白釋放到細胞漿內(nèi)，引發(fā)Caspase的級聯(lián)反應(yīng)。目前，眾多的研究者認為：Caspase的級聯(lián)反應(yīng)是各種凋亡途徑的主要共同下游通路，其中Caspase-3被認為是細胞凋亡的過程中的終末剪切酶，一旦Caspase-3被激活，細胞凋亡則難以避免，Caspase-3表達越高，凋亡發(fā)生概率越高[10]。因此，Caspase-3的表達增加是檢測細胞凋亡發(fā)生的重要指標。本實驗發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境中心肌細胞Caspase-3表達明顯增加，EGB干預(yù)后，心肌細胞Caspase-3的表達明顯降低，提示高糖可促使心肌細胞的凋亡，EGB可有效減少心肌細胞的凋亡。這結(jié)果與本課題的心肌細胞凋亡的檢測結(jié)果相符合。

因此，筆者推測：高糖環(huán)境中心肌細胞中Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，Bcl-2雖然可使Bax蛋白失活，但Bax過度表達，Bcl-2低表達，使Bax/Bcl-2的比值升高，促使早期凋亡信息轉(zhuǎn)導(dǎo)下行。同時，線粒體分裂蛋白Drp-1表達增加，Mfn-2表達降低，進而線粒體外膜上Drp-1/Mfn-2比值增高，則改變線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，致使凋亡效應(yīng)蛋白釋放到細胞漿內(nèi)，激活凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路即Caspase通路的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[6]。EGB通過抑制Bax/Bcl-2-Drp-1/Mfn-2-Caspase-3線粒體凋亡途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而保護高糖對心肌細胞的損傷。這可能是EGB對防治糖尿病心肌病的機制之一。

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（本文編輯：吳健敏）

Effects of extract of Ginkgo biloba on apoptosis and the expression of Drp-1, Mfn-2 in myocardial cells induced by high glucose and its underlying mechanism

LI Jianmin, WU Ling, ZHANG Di, ZHENG Jingyu,DAI Shuang, YUAN Fengju, WU Huan, PENG Tianqing. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the effects of Ginkgo biloba on apoptosis and the expression of Drp-1, Mfn-2, Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in mitochondrial apoptotic pathway in neonatal rat myocardial cells induced by high glucose and underlying mechanism. Methods: Left ventricule myocardial cells of neonatal SD rats were isolated and cultured with low-glucose culture media (LG group), low-glucose culture media added EGB (LG + EGB group), high-glucose culture media (HG group) and high-glucose culture media added EGB (HG+EGB group) in vitro respectively. The ratio of apoptosis of myocardial cells was analyzed by flow cytometry. The expression of Drp-1, Mfn-2, Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were detected with western blot and/or RT-PCR respectively. Results: Compared to the LG group, the rate of apoptosis, the expression of Drp-1 and Bax, Caspase-3 and the ratio of Bax/Bcl-2 in ventricule myocardial cells were increased in HG group significantly (P＜0.05), while the expression of Mfn-2 and Bcl-2 were decreased significantly (P＜0.05). Compared to HG group, the rate of apoptosis, the expression of Drp-1 and Bax, Caspase-3 and the ratio of Bax/Bcl-2 in HG+EGB group were decreased significantly (P＜0.05), while the expression of Bcl-2 was increased significantly (P＜0.05). But the expression of Mfn-2 had no significant difference (P＞0.05). Conclusion: EGB plays an important role in attenuation cardiomyocyte apoptosis induced by high glucose via its upregulation the expression of Bcl-2 and down regulation of Drp-1 and Bax, Caspase-3 and the ratio of Bax/Bcl-2. It may be one of the underlying mechanisms for EGB to treat diabetic cardiomyopathy.

diabetes mellitus; extract of Ginkgo biloba; cardiomyocyte; mitochondria; apoptosis

R587.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.002

2015-02-15

國家自然科學基金資助項目（81170204）；浙江省自然科學基金資助項目（Y14H020038）。

李劍敏（1967-），男，浙江樂清人，教授。

彭天慶，教授，Email：wzpengtq@163.com。