施益芬，鄭周懿，陳晶晶，錢珊瑚，歷嘉琪，俞康

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035）

·論 著·

TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白甲基化修飾在苯中毒致造血毒性中的作用

施益芬1，鄭周懿2，陳晶晶2，錢珊瑚2，歷嘉琪2，俞康1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035）

目的：研究拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOPO）Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子（SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90）組蛋白甲基化修飾在苯中毒致造血毒性中的作用。方法：25例臨床慢性苯中毒患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞為病例組，25例正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞為對(duì)照組，染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）技術(shù)探討TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子組蛋白甲基化水平的變化，RT-PCR法測(cè)定TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子mRNA表達(dá)水平的改變。結(jié)果：①與對(duì)照組比較，病例組TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子NF-M、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）；SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），而ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90組蛋白H3K9甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）。②與對(duì)照組比較，病例組TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），ATF-2、ICBP90 mRNA表達(dá)水平不變（P＞0.05），SP3、P53 mRNA表達(dá)水平則升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：①慢性苯中毒TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白化學(xué)修飾水平的改變伴隨著調(diào)控因子mRNA水平的變化。②TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白甲基化修飾在苯中毒所致的造血毒性中發(fā)揮一定的作用。

苯；拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子；組蛋白甲基化；染色質(zhì)免疫沉淀分析法

苯是明確的職業(yè)致癌物，工業(yè)用途廣泛。苯接觸從業(yè)人員多，苯誘發(fā)的造血系統(tǒng)疾病發(fā)病率高，衛(wèi)生部2010年職業(yè)病防治工作和2011年重點(diǎn)工作情況通報(bào)中，苯中毒均位列慢性職業(yè)中毒前3位。盡管苯所致造血毒性已得到廣泛重視[1]，但其毒性機(jī)制仍未闡明。近年來，拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOPO）在苯致造血毒性中的作用日益受到關(guān)注[2-3]。本課題組前期的研究顯示，苯及其代謝物影響骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPO Ⅱα表達(dá)及活性，TOPO Ⅱα啟動(dòng)子組蛋白乙?；?、甲基化水平改變是其含量下降的機(jī)制之一[3-5]。本研究進(jìn)一步探討TOPO Ⅱα表達(dá)降低是否還伴隨著TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白化學(xué)修飾水平的改變，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)苯中毒相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 取本院血液科臨床慢性苯中毒患者（病例組）的骨髓標(biāo)本25份，其中男9例，女16例，平均年齡32.5歲（20～56歲），苯接觸時(shí)間≥6個(gè)月（6個(gè)月～5年）。工作環(huán)境中苯濃度平均為87 mg/ m3（50～1 000 mg/m3），超過時(shí)間加權(quán)平均容許濃度（PC-TWA，6 mg/m3）及短時(shí)間接觸容許濃度（PC-STEL，10 mg/m3）。25例年齡、吸煙、飲酒習(xí)慣等匹配的健康志愿者為對(duì)照組，男11例，女14例，平均年齡33.8歲（19～58歲）。苯中毒診斷依據(jù)：GBZ 68-2002《職業(yè)性苯中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》。本研究已通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)證。所有骨髓捐獻(xiàn)者簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 淋巴細(xì)胞分離液（天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心），染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）檢測(cè)試劑盒、抗二甲基組蛋白H3K9抗體、抗三甲基組蛋白H3K4抗體（美國(guó)Upstate公司），體積分?jǐn)?shù)為37%的甲醛溶液（美國(guó)Sigma公司），Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA），platinum R PCR Super Mix（Invitrogen，Carlsbad，CA），GeneRulerTM50 bp DNA Ladder（MBI Fermentas）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備：取病例組及對(duì)照組骨髓5 mL，肝素（50 U/mL）抗凝，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液。錐蟲藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞率，要求拒染率達(dá)95%以上。骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106個(gè)/mL。

1.3.2 ChIP：按ChIP檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞用終濃度為1%的甲酰胺固定10 min，使轉(zhuǎn)錄因子與DNA交聯(lián)，用細(xì)胞裂解液破膜后，通過超聲將DNA打碎成250～1 000 bp（此處提取的DNA片段命名為input DNA）。用特異性抗體（甲基化組蛋白H3K4、H3K9抗體）沉淀DNA-蛋白復(fù)合物，用蛋白A瓊脂吸附復(fù)合物，經(jīng)洗去非特異性吸附后，解交聯(lián)，沉淀的DNA片段于-20 ℃保存?zhèn)溆茫ù薉NA片段命名為ChIPed DNA）。ChIPed DNA通過PCR法對(duì)目標(biāo)基因（TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子）進(jìn)行分析。

1.3.3 PCR擴(kuò)增ChIP（甲基化組蛋白H3K4、H3K9抗體染色質(zhì)免疫共沉淀）后DNA產(chǎn)物：①針對(duì)TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子的DNA序列設(shè)計(jì)引物（各調(diào)控因子的DNA引物序列、產(chǎn)物、退火溫度見表1）。②擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min 預(yù)變性，94 ℃ 30 s，各調(diào)控因子退火溫度30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 30 min。反應(yīng)完成后用1.8%瓊脂糖凝膠電泳并照相，Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子的DNA引物

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：①RNA的提取及cDNA合成：采用Trizol法提取病例組及對(duì)照組細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法合成cDNA。②針對(duì)TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子mRNA序列設(shè)計(jì)引物（各調(diào)控因子的mRNA引物序列、產(chǎn)物、退火溫度見表2）。引物與GenBank基因序列核對(duì)無誤，采用β2微球蛋白作為內(nèi)參照，上游：5’-ACCCCCACTGAAAAAGATG A-3’，下游：5’-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3’，產(chǎn)物115 bp，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。③擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s，各調(diào)控因子產(chǎn)物退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，Quantity one圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以目標(biāo)基因與β2微球蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值的比值計(jì)算表達(dá)水平。

表2 TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子mRNA引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以±s表示，t檢驗(yàn)來確定2組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子DNA水平的變化

2.1.1 與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子DNA水平變化：與對(duì)照組比較，病例組NF-M、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、ICBP90組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）。見表3、圖1。

表3 與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子DNA水平變化（n=5，±s）

2.1.2 與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子DNA水平變化：與對(duì)照組比較，SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；ATF-2、SP3、NF-YA、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90組蛋白H3K9甲基化水平無明顯改變（P＞0.05）。見表4、圖2。

2.2 TOPO IIα啟動(dòng)子調(diào)控因子mRNA水平的變化

SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；SP3、P53 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；ATF-2、ICBP90 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖3。

3 討論

自1996年Frantz等首次提出苯的活性代謝產(chǎn)物抑制TOPO Ⅱ的活性開始，TOPO在苯致造血毒性中的作用日漸明確[2-3]，目前認(rèn)為，苯的代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致TOPO功能失常，繼而導(dǎo)致DNA損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或畸變，最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。

組蛋白的化學(xué)修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP2核糖化等，這些修飾改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失常。近年來，組蛋白的化學(xué)修飾尤其是組蛋白的甲基化及其在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中所起的作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。組蛋白H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)[6]，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉(zhuǎn)錄沉默[7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)苯所致造血毒性與TOPO Ⅱα的表達(dá)下降相關(guān)，而TOPO Ⅱα啟動(dòng)子組蛋白化學(xué)修飾改變是其表達(dá)下降的機(jī)制之一[3-5]，TOPO Ⅱα表達(dá)降低還伴隨著TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白乙?；降母淖儯〝?shù)據(jù)另文發(fā)表）。

圖1 苯中毒患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子DNA水平變化（ChIP）

表4 與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子DNA水平變化（n=5，±s）

已知的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子包括SP1[8]、 ATF-2[9]、SP3[10]、NF-YA[11]、NF-M[12]、C-MYB[13]、P53[14]、ICBP90[15]、C-JUN[16]。其中，SP1、ATF-2、NF-YA、NF-M、C-MYB、ICBP90、C-JUN通過與啟動(dòng)子不同的特異區(qū)域結(jié)合上調(diào)TOPO Ⅱα啟動(dòng)子的活性。如SP1通過其三個(gè)“鋅指結(jié)構(gòu)”與TOPO Ⅱα啟動(dòng)區(qū)的GC/GT盒結(jié)合，增強(qiáng)TOPO ⅡmRNA的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)TOPO Ⅱ的表達(dá)[8]，NF-YA、ICBP90轉(zhuǎn)錄因子分別與TOPO Ⅱ啟動(dòng)子區(qū)的ICBs、CCAAT結(jié)合后激活TOPO Ⅱα的表達(dá)[11，15]。SP3及P53是TOPO Ⅱα啟動(dòng)子的負(fù)性調(diào)控因子。SP3同樣含有3個(gè)可與GC/GT盒結(jié)合的“鋅指結(jié)構(gòu)”，可與SP1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GC/GT盒位點(diǎn)，但SP3的轉(zhuǎn)錄活性較低，因此競(jìng)爭(zhēng)性抑制了由SP1介導(dǎo)的TOPO Ⅱ啟動(dòng)子的促轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)TOPO Ⅱ的表達(dá)[10]。而抑癌基因P53的表達(dá)會(huì)抑制TOPO Ⅱα啟動(dòng)子的活性，使TOPO Ⅱα表達(dá)受抑[14]。

圖2 苯中毒患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子DNA水平的變化（ChIP）

表5 TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子mRNA水平變化（n=5，±s）

我們的研究發(fā)現(xiàn)慢性苯中毒患者TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子NF-M、C-JUN組蛋白H3K4甲基化水平降低，SP1、NF-M組蛋白H3K9甲基化水平升高，結(jié)合組蛋白H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)[6]，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉(zhuǎn)錄沉默[7]，及各調(diào)控因子對(duì)TOPO Ⅱ表達(dá)的影響，提示TOPO Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白NF-M、C-JUN、SP1組蛋白甲基化水平的改變可能參與了TOPO Ⅱα表達(dá)的降低，DNA水平證實(shí)了苯中毒患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中TOPO Ⅱα啟動(dòng)子的調(diào)控因子水平的改變，且伴隨著NF-M、C-JUN、SP1、NF-YA、C-MYB mRNA表達(dá)水平的降低，與TOPO Ⅱα啟動(dòng)子的調(diào)控因子DNA水平的變化平行，為TOPO Ⅱα啟動(dòng)子的調(diào)控因子組蛋白甲基化水平改變參與TOPO Ⅱα表達(dá)減低提供了一定的依據(jù)。本課題組將進(jìn)一步研究組蛋白去甲基化酶對(duì)造血損傷的逆轉(zhuǎn)及對(duì)TOPO Ⅱα啟動(dòng)子、啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白化學(xué)修飾的改變，為更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)苯中毒相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)疾病的診療提供一定的依據(jù)。

圖3 苯中毒患者TOPO Ⅱα啟動(dòng)子各調(diào)控因子mRNA水平的變化（RT-PCR）

[1] Takahashi M, Tsujimura N, Yoshino T, et a1. Assessment of benzene-induced hematotoxicity using a human-like hematopoietic lineage in NOD/Shi-scid//IL-2Rγ null mice[J]. PLOS One, 2012, 7(12): e50448.

[2] Lindsey RH, Bender RP, Osheroff N. Stimulation of topoisomerase II-mediated DNA cleavage by benzene metabolites[J]. Chem Biol Interact, 2005, 153-154: 197-205.

[3] Yu K, Shi YF, Yang KY, et a1. Decreased topoisomerase IIα expression and altered histone and regulatory factors of topoisomerase IIα promoter in patients with chronic benzene poisoning[J]. Toxicol Lett, 2011, 203(2): 111-117.

[4] 施益芬, 俞康, 陳怡, 等. 氫醌對(duì)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα表達(dá)的影響[J]. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2010, 28(9): 660-663.

[5] 施益芬, 俞康, 陳怡, 等. 氫醌對(duì)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα表達(dá)的影響及其可能機(jī)制[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 40(2): 164-167.

[6] Hampsey M, Reinberg D. Tails of intrigue: phosphorylation of RNA polymerase II mediates histone methylation[J]. Cell, 2003, 113(4): 429-432.

[7] Richards EJ, Elgin SC. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects [J]. Cell, 2002, 108(4): 489-500.

[8] Magan N, Szremska AP, Isaacs RJ, et al. Modulation of DNA topoisomerase II alpha promoter activity by members of the Sp (specificity protein) and NF-Y (nuclear factor Y) families of transcription factors[J]. Biochem J, 2003, 374(Pt 3): 723-729.

[9] Son MY, Kim TJ, Kweon KI, et al. ATF is important to late S phase-dependent regulation of DNA topoisomerase IIalpha gene expression in HeLa cells[J]. Cancer Lett, 2002, 184(1): 81-88.

[10] Hagen G, Müller S, Beato M, et al. Sp1-mediated transcription activation is repressed by Sp3[J]. EMBO J, 1994, 13 (16): 3843-3851.

[11] Joshi AA, Wu Z, Reed RF, et al. Nuclear factor-Y binding to the topoisomerase IIalpha promoter is inhibited by both the p53 tumor suppressor and anticancer drugs[J]. Mol Pharmacol, 2003, 63(2): 359-367.

[12] Brandt TL, Kroll DJ. NF-M trans-activates the human DNA topoisomerase II alpha promoter independently of c-Myb in HL-60 cells[J]. Leuk Res, 1997, 21(8): 711-720.

[13] Brandt TL, Fraser DJ, Leal S, et al. c-Myb trans-Activates the Human DNA Topoisomerase IIa Gene Promoter[J]. J Biol Chem, 1997, 272(10): 6278-6284.

[14] Wang Q, Zambetti GP, Suttle DP. Inhibition of DNA topoisomerase IIa gene expression by the p53 tumor suppressor [J]. Mol Cell Biol, 1997, 17(1): 389-397.

[15] Trotzier MA, Bronner C, Bathami K, et al. Phosphorylation of ICBP90 by protein kinase A enhances topoisomerase IIalpha expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 319(2): 590-595.

[16] Kroll DJ, Sullivan DM, Gutierrez-Hartmann A. Modification of DNA topoisomerase II activity via direct interactions with the cyclic adenosine-3’, 5’-monophosphate response element-binding protein and related transcription factors[J]. Mol Endocrinol, 1993, 7(3): 305-318.

（本文編輯：丁敏嬌）

Histone methylation modification of topoisomerase IIα promoter regulation factors in patients with chronic benzene poisoning

SHI Yifen1, ZHENG Zhouyi2, CHEN Jingjing2, QIAN Shanhu2, LI Jiaqi2, YU Kang1. 1. De-partment of Hematology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate histone methylation modification of topoisomerase IIα (TOPO IIα) promoter regulation factors in patients with chronic benzene poisoning, to explore the possible regulatory mechanism of TOPO IIα involved in toxicity of chronic benzene poisoning. Methods: The bone marrow samples were cellected from 25 chronic benzene poisoning cases and 25 normal controls. The Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay was carried out to study the possible mechanism of TOPO IIα promoter regulation factors expression changes.TOPO IIα promoter regulation factors mRNA were detected by RT-PCR technique. Results: Compared with the normal controls, the histone H3K4 methylation level of TOPO IIα promoter regulation factors NF-M, C-JUN in chronic benzene poisoning patients decreased (P＜0.05), while the histone H3K4 methylation level of SP1, ATF-2, SP3, NF-YA, P53, C-MYB, ICBP90 without obvious change (P＞0.05). The histone H3K9 methylation level of SP1, NF-M increased (P＜0.05 or P＜0.01), while the histone H3K9 methylation level of ATF-2, SP3, NF-YA, P53, C-MYB, C-JUN, ICBP90 was no significant change (P＞0.05). The mRNA expression of TOPO IIα promoter regulation factors SP1, NF-YA, C-MYB, NF-M and C-JUN were significantly lower than that in the control (P＜0.05 or P＜0.01), while the expression of SP3, P53 mRNA increased (P＜0.05 or P＜0.01), ATF-2, ICBP90 mRNA wasn’t changed (P＞0.05). Conclusion: In chronic benzene poisoning patients, TOPO IIα promoter regulation factors histone modification changes accompanied with mRNA level changed. Histone methylation modification of topoisomerase enzyme IIα promoter regulation factors play an important role in the benzene’s hematopoietic toxicities.

benzene; topoisomerase IIα promoter regulation factors; histone methylation; ChIP

R135.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.001

2015-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172613）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120004，Y20090238）。

施益芬（1981-），女，浙江永嘉人，主治醫(yī)師，碩士。

俞康，教授，博士生導(dǎo)師，Email：yukang62@126.com。