魏婷婷，鄭涌泉，王慧，夏歡歡，許翠翠，葉信健，趙良才，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 代謝組學(xué)與醫(yī)藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

·論 著·

2型糖尿病小鼠小腦代謝物的1H NMR研究

魏婷婷，鄭涌泉，王慧，夏歡歡，許翠翠，葉信健，趙良才，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 代謝組學(xué)與醫(yī)藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

目的：通過離體的高分辨核磁共振氫譜（1H NMR）技術(shù)研究2型糖尿病db/db小鼠小腦的代謝變化。方法：采用8只15周齡2型糖尿病模型db/db小鼠為實驗組，11只15周齡野生正常小鼠為對照組，對其小腦組織進行離體的1H NMR檢測分析。結(jié)果：實驗組與對照組相比小腦的代謝模式明顯不同，甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、丙氨酸（Ala）等代謝物濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；谷氨酰胺（Gln）、?；撬幔═au）、乳酸（Lac）等代謝物水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：代謝組學(xué)結(jié)果說明2型糖尿病模型db/db小鼠小腦中糖代謝、氨基酸代謝出現(xiàn)了紊亂，這為進一步認(rèn)識糖尿病腦病的發(fā)病機制提供了線索。

代謝組學(xué)；糖尿病，2型；代謝物；核磁共振；db/db小鼠

糖尿病作為一個常見的慢性代謝類疾病，已經(jīng)嚴(yán)重影響了人類的生活。WHO最新的流行病學(xué)資料顯示全世界已有3.47億人患有糖尿病[1]，這一數(shù)字還在不斷增長，其中2型糖尿病占90%以上[2]。糖尿病腦病作為糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥開始越來越受到關(guān)注[3]。研究顯示，糖尿病患者大腦在長期的高血糖狀態(tài)下代謝發(fā)生紊亂，其中包括生化特征改變、神經(jīng)生理學(xué)、形態(tài)學(xué)變化以及認(rèn)知功能障礙等[4]。然而此類腦病的發(fā)病機制目前還不清楚。

基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)已成功應(yīng)用于疾病的發(fā)病機制、早期診斷以及治療研究，越來越顯示出其在生命科學(xué)領(lǐng)域的重要地位[5]。本研究對象db/db小鼠為經(jīng)典的2型糖尿病小鼠模型，小腦不僅僅與運動有關(guān)，而且參與非運動的認(rèn)知功能[6]。本研究將利用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學(xué)方法分析2型糖尿病模型db/db小鼠小腦的整體代謝特征，這可能為闡明2型糖尿病腦病潛在發(fā)病機制提供重要的線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性2型糖尿病模型db/db小鼠（BKS.Cg-m+/+Leprdb/J）8只（15周齡）為實驗組，雄性野生型小鼠11只（15周齡）為對照組，購自南京大學(xué)模式動物研究所，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，自早上8∶00開始12 h交替照明。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周再進行實驗，實驗期間自由飲水、進食，所有的操作程序嚴(yán)格遵守NIH的實驗動物飼養(yǎng)和使用手冊。飼養(yǎng)至17周斷頭處死，在冰上分離小腦，迅速置于液氮中猝滅，將收集的樣本置于-80 ℃超低溫冰箱中儲存待測。

1.2 試劑與儀器 三甲硅烷基丙磺酸鈉（TSP）購自Sigma-Aldrich公司；D2O（99.9%氘代）購于劍橋同位素實驗室；甲醇和氯仿購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，MA，USA）生產(chǎn)。使用Bruker AVANCE I I I 600 MHz NMR波譜儀（Bruker BioSpin International AG）進行分析，低溫離心機5415R（eppendorf Inc，Germany）離心。

1.3 方法

1.3.1 組織萃?。簩⒈鶅鼋M織稱質(zhì)量并放入離心管中，應(yīng)用甲醇-氯仿-水按一定比例萃取，離心后取上清液，凍干24 h，重新溶解于500 mL D2O中進行NMR檢測。

1.3.21H NMR檢測：于600 MHz NMR波譜儀上進行NMR采集實驗，累加采樣256次，數(shù)據(jù)采集點為32 K，譜寬為12 000 Hz，弛豫延遲10 s。進行傅立葉變換前，將采集的FID信號充零至64 K，并加窗函數(shù)LB=0.3。使用Topspin 2.1軟件對所有的1H NMR譜圖都進行相位校正、基線調(diào)整，并以乳酸的甲基峰的化學(xué)位移為1.33 ppm定標(biāo)。

1.3.3 NMR波譜數(shù)據(jù)處理和模式分析：將1H NMR譜從δ-0.2～8.8 ppm按0.01 ppm為單位進行自動分段積分[7]，為了消除預(yù)飽和壓水峰時引起的譜線扭曲，將δ5.85～4.60 ppm區(qū)域設(shè)為0積分段。對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+12.0軟件包（瑞典Umetrics 公司），進行多元統(tǒng)計分析。偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）用于代謝模式和重要代謝物的研究。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 13.0軟件將歸一化后的積分值導(dǎo)入作統(tǒng)計學(xué)分析。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠體質(zhì)量和血糖測定 實驗組小鼠“三多一少”糖尿病癥狀表現(xiàn)明顯，且覓食過程比對照組緩慢。13周齡實驗組小鼠體質(zhì)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。實驗組小鼠空腹血糖值持續(xù)≥16.7 mmol/L，見表1。

表1 2組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖值比較（±s）

表1 2組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖值比較（±s）

與對照組比：aP＜0.01

2.2 2組小腦組織1H NMR譜圖及PLS-DA分析 腦組織提取物的1H NMR波譜可以同時測量多種內(nèi)源性代謝物，于圖中標(biāo)出丙氨酸（Ala，δ 1.46），乳酸（Lac，δ 1.33），γ-氨基丁酸（GABA，δ 2.29），N-乙酰天門冬氨酸（NAA，δ 2.02），谷氨酸（Glu，δ 2.35），天冬氨酸（Asp，δ 2.82），谷氨酰胺（Gln，δ 2.45），琥珀酸（Suc，δ2.40），肌酸（Cr，δ3.03），膽堿（Cho，δ 3.20），?；撬幔═au，δ 3.42），甘氨酸（Gly，δ 3.55）和肌醇（m-Ins，δ 4.06），見圖1。2組代謝特征明顯不同，Lac、Tau、NAA、Cho等代謝物對2組間分離貢獻較大，見圖2。

圖1 對照組小鼠（A）和實驗組小鼠（B）小腦典型的1H NMR波譜圖

2.3 2組小鼠代謝物變化情況 與對照組相比，實驗組小鼠小腦中Lac、Gln和Tau水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；Gly、Aap、Glu、GABA、NAA和Ala水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；m-Ins、Cre、Cho和Suc變化差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

3 討論

本實驗對2型糖尿病模型db/db小鼠小腦的代謝輪廓和代謝變化進行分析，標(biāo)出的代謝物都基于我們前期已發(fā)表的研究成果[6，8]，并且經(jīng)過2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗證。我們發(fā)現(xiàn)持續(xù)的高血糖能夠明顯影響神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)代謝，包括一些重要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如Glu、Gln、GABA、Asp和Gly，表明2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)神經(jīng)元的興奮性程度發(fā)生了改變。除此之外，能量代謝產(chǎn)物L(fēng)ac和Ala的變化揭示了其小腦能量代謝的改變。

圖2 模式識別分析結(jié)果

圖3 小腦內(nèi)各代謝物相對濃度柱狀圖

3.1 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂 Glu是腦中最重要、分布最廣的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[9]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理、病理以及毒理學(xué)研究中有著重要的意義[8]。近年來，越來越多的研究證實哺乳動物腦內(nèi)存在兩個代謝區(qū)間，其中一個是神經(jīng)元代謝區(qū)間，另一個是神經(jīng)膠質(zhì)代謝區(qū)間。神經(jīng)元釋放出的Glu被星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)化為Gln，Gln再被送回神經(jīng)元而轉(zhuǎn)化為Glu，見圖4。這種發(fā)生在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)稱為Gln-Glu循環(huán)[10]。我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)Glu、GABA含量顯著性降低，Gln含量顯著性升高，可能是Gln在向谷氨酸能神經(jīng)元和γ-氨基酸能神經(jīng)元運輸過程發(fā)生障礙，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞Gln含量升高，也有可能是持續(xù)的高血糖使得腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過度增生。Gln-Glu循環(huán)的紊亂，間接反映小腦中神經(jīng)元代謝區(qū)間和神經(jīng)膠質(zhì)代謝區(qū)間可能存在紊亂。此外，我們發(fā)現(xiàn)小腦興奮性氨基酸Asp和抑制性氨基酸Gly也出現(xiàn)顯著性下降，進一步證實氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)可能存在代謝紊亂。

圖4 腦中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間Gln-Glu循環(huán)圖

3.2 能量代謝紊亂 腦能量需求幾乎全部來自線粒體中葡萄糖的氧化代謝，當(dāng)神經(jīng)元對能量的需求超過氧化代謝速率時，Lac就會作為能量底物而被利用[11]。與野生型對照組相比，我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)乳酸含量明顯升高，而Ala含量明顯降低，這可能是由于能量底物葡萄糖在2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)無氧酵解途徑增強，能量利用率降低。但是，我們發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物Suc的含量并沒有顯著性變化，說明腦內(nèi)的有氧呼吸途徑改變不明顯，這很可能是由Glu通過轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸進入到三羧酸循的途徑增強，Glu含量下降與上述分析一致。綜上所述，我們認(rèn)為2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)能量代謝出現(xiàn)障礙，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞無氧降解途徑增強，能量代謝障礙，為了彌補能量的空缺，使得Glu等能量代謝旁路途徑代謝增強，這同樣與小腦中Glu含量顯著降低一致。

3.3 其他代謝產(chǎn)物變化 NAA通常被認(rèn)為是神經(jīng)元的標(biāo)志物，它的升高或降低都與神經(jīng)元活性息息相關(guān)[12]，在2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)我們發(fā)現(xiàn)NAA明顯降低。這表明，高血糖狀態(tài)下2型糖尿病模型db/db小鼠可能發(fā)生神經(jīng)元功能性障礙。Tau被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的標(biāo)志物，它對調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)滲透壓起到重要作用[13]。小腦中Tau水平顯著性升高，這說明持續(xù)高血糖會影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。Cr是一種氨基酸，經(jīng)過磷酸化作用，作為能量儲存在細(xì)胞中[14]。在1H NMR譜中，Cr峰的位置相對穩(wěn)定，在絕大部分疾病發(fā)生時，腦內(nèi)Cr濃度幾乎保持恒定狀態(tài)[15]，這和我們觀察到的小腦Cr差異無統(tǒng)計學(xué)意義是一致的。Cho是細(xì)胞膜的主要成分，它的變化可能與腫瘤和組織炎癥的發(fā)生有關(guān)[16]。小腦中Cho的降低可能暗示了持續(xù)高血糖使小鼠小腦內(nèi)細(xì)胞的新陳更替程度降低。

本實驗應(yīng)用1H NMR技術(shù)研究2型糖尿病db/db小鼠小腦的代謝變化?；?H NMR的代謝組學(xué)結(jié)果表明2型糖尿病db/db小鼠小腦內(nèi)的代謝輪廓與野生型對照小鼠相比發(fā)生了明顯改變；代謝物的定量1H NMR分析表明2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和能量代謝出現(xiàn)異常。這些結(jié)果提示2型糖尿病db/db小鼠小腦中Gln-Glu循環(huán)平衡被打破，糖酵解途徑增強。近年來，越來越多的研究證實小腦與認(rèn)知、行為及精神疾病密切相關(guān)[5，17]。行為學(xué)數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，2型糖尿病模型db/db小鼠在水迷宮實驗中表現(xiàn)為潛伏時間延長并且穿臺次數(shù)顯著減少，出現(xiàn)了明顯的認(rèn)知功能障礙，Gln-Glu循環(huán)和糖酵解途徑的紊亂可能參與了高血糖引起的小腦纖維聯(lián)系與非運動認(rèn)知功能紊亂的發(fā)病過程[18]。本實驗從代謝水平初步探討了糖尿病腦損傷的可能機制，為深入認(rèn)識糖尿病腦病的分子機制提供了一定的理論依據(jù)。

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（本文編輯：吳彬）

1H NMR-based metabonomic study on cerebellum of type 2 diabetes mellitus model

WEI Tingting,ZHENG Yongquan, WANG Hui, XIA Huanhuan, XU Cuicui, YE Xinjian, ZHAO Liangcai, GAO Hongchang.Institute of Metabonomics & Medical NMR, School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To investigate the diabetes-related metabolic changes in the cerebellum of db/db mice.Methods:Specimens of the cerebellum were dissected from the 17-week db/db mice and the age-matched controls.The cerebellum tissue samples were extracted and analyzed by1H NMR-based metabonomics.Results: Compared to the controls, the db/db mice exhibited markedly different metabolic profles, which included signifcant decrease in the levels of glycine (P＜0.01), aspartate (P＜0.01), glutamate (P＜0.01), GABA (P＜0.01), N-acetyl-aspartate (P＜0.01) and alanine (P＜0.05) and increase in the levels of glutamine (P＜0.01), taurine (P＜0.05) and lactate (P＜0.01).Conclusion:These metabolic changes suggest that glucose metabolism and amino acid metabolism in the cerebellum of db/db mice are disordered, which provides clues for further understanding the pathogenesis of diabetic encephalopathy.

metabonomics; diabetes, type 2; metabolite; NMR; db/db mice

R34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.009

2014-10-08

溫州醫(yī)科大學(xué)2012年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（201210343009）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY14H090014，LY13H070005）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金-新教師類資助項目（20133321120006）；溫州市科技計劃項目（Y20100005）。

魏婷婷（1990-），女，浙江金華人，碩士生。

高紅昌，教授，博士生導(dǎo)師，Email：gaohc27@wmu.edu.cn。