吳 鵬，王知龍，吳 秀

（黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃岡438000）

黑曲霉HS-5高產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

吳 鵬，王知龍，吳 秀

（黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃岡438000）

利用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定酶活，優(yōu)選黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的發(fā)酵條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，得到最佳發(fā)酵條件為接種量3.11%，初始pH值為6.09，發(fā)酵時(shí)間60.02 h。在此最佳條件下，測(cè)得β-葡聚糖酶的酶活力為20.03 U/m L，比初始酶活力12.98 U/m L提高了154%。

黑曲酶；β-葡聚糖酶；工藝優(yōu)化；響應(yīng)面法

β-葡聚糖酶是一種能高效、專一地降解β-葡聚糖的內(nèi)切酶，可使其降解為低分子質(zhì)量片段[1]。它是一類存在于禾谷類的糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中的水解酶類總稱，由于β-葡聚糖的存在會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率降低，已成為麥類飼料的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其酶的開(kāi)發(fā)與研究已日益受到關(guān)注[2-3]。

β-葡聚糖酶用途廣泛，但是由于生產(chǎn)提純過(guò)程復(fù)雜、產(chǎn)量很小，故其應(yīng)用受到限制。目前β-葡聚糖酶作為一種重要的工業(yè)酶，在飼料、食品、造紙、紡織、日化等領(lǐng)域發(fā)揮著重大的作用，其來(lái)源主要是用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵方法一般有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種[4-9]。液體發(fā)酵具有原料來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、菌體生長(zhǎng)快速、能有效降低菌種污染率、工廠化生產(chǎn)、無(wú)季節(jié)性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)越來(lái)越多地被應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中[10-12]。本實(shí)驗(yàn)以黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5菌種作為菌源，利用液體發(fā)酵法生產(chǎn)β-葡聚糖酶，運(yùn)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)內(nèi)β-葡聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得β-葡聚糖酶生產(chǎn)的最佳工藝條件，優(yōu)化產(chǎn)酶發(fā)酵的工藝條件，提高酶生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，充分發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價(jià)值，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5菌株由黃岡師范學(xué)院食品加工技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：蔗糖8.0%、酵母膏2.0%、硝酸銨2.0%、醋酸鈉0.1%、抗壞血酸1.0%、CaCO30.3%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、pH 6.4、滅菌條件：121℃、20 m in。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-723型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FAl004電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；LX-B50L立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；RB-CJ-1ND超凈工作臺(tái)：北京瑞邦興業(yè)科技有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱：中儀國(guó)科（北京）科技有限公司；THZ-82水浴振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5菌株活化后，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到生長(zhǎng)旺盛的菌種，然后再通過(guò)液體培養(yǎng)得到液體發(fā)酵液，取液體發(fā)酵培養(yǎng)好的發(fā)酵懸浮液，抽濾即得粗酶液。

1.3.2 酶活檢測(cè)方法

根據(jù)曹利群[14]的3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）酶活測(cè)定法：取4 m L粗酶液，用0.2 mol/L、pH值5.5的檸檬酸緩沖液稀釋50倍，取經(jīng)40℃預(yù)熱的此稀釋液1.0 m L，加入經(jīng)40℃預(yù)熱的1.0%葡聚糖溶液1.0 m L，混勻，40℃下恒溫反應(yīng)10 m in，然后加入3.0 m L DNS停止反應(yīng)，搖勻，100℃水浴5 min，冷卻至室溫后用去離子水定容至5.0 m L，在540 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定吸光度值A(chǔ)540nm。以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)540nm（y）值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=2 260.2x+12.174[14]（R2= 0.999 3），計(jì)算酶活力。

β-葡聚糖酶活力單位定義為：1 m L酶液在pH值為5.5、40℃條件下，每分鐘分解β-葡聚糖生成l μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U/m L）。

1.3.3 產(chǎn)酶單因素條件研究

不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響：裝液量均為50m L/250m L，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%在30℃、150 r/m in進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵48 h測(cè)定β-葡聚糖酶活力。

不同初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響：裝液量均為50m L/250m L，接種量2%，對(duì)其初始pH進(jìn)行設(shè)計(jì)試驗(yàn)，調(diào)整發(fā)酵液的初始pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他條件均不變，發(fā)酵48 h測(cè)定β-葡聚糖酶活力。

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響：發(fā)酵30 h后，每間隔6 h測(cè)定一次酶活?；景l(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵時(shí)間分別調(diào)整為36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h，其他條件不變，測(cè)定β-葡聚糖酶活力。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件[15]

為了更加準(zhǔn)確確定最佳發(fā)酵條件及了解各因素之間的交互作用，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以β-葡聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值，對(duì)黑曲霉高產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件進(jìn)行Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Fac tors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖1所示。

圖1 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of different inoculum on enzyme activity

由圖1可知，當(dāng)接種量為3%時(shí)，發(fā)酵液酶活力最高。接種量的多少主要影響菌體的生長(zhǎng)速度和細(xì)胞活性，接種量過(guò)大菌體生長(zhǎng)快，但易衰老。接種量過(guò)小，則菌體生長(zhǎng)慢，不能形成正常的菌體量以控制新陳代謝，必然會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期。接種量＜3%時(shí)，酶活力隨接種量的增大而增高，接種量＞3%時(shí)，酶活力隨接種量的增大反而降低。故選擇接種量為3%。

2.2 不同pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵液的初始pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖2所示。

圖2 不同pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of different pH on enzyme activity

菌株生長(zhǎng)需要合適的pH，在一定的pH值范圍內(nèi)，細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)、繁殖和維持正常的新陳代謝，產(chǎn)物合成也需要適宜的pH值。由圖2可知，初始pH 4.0～5.5酶活力較低，相差無(wú)幾。初始pH值為6.0酶活最高，故選擇發(fā)酵初始pH值為6.0。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間分別為36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖3所示。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on enzyme activity

由圖3可知，36 h以后發(fā)酵液酶活力逐漸升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在發(fā)酵60 h時(shí)酶活力達(dá)到最高，60 h以后酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，故選擇發(fā)酵時(shí)間為60 h。2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

選取接種量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，以β-葡聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

運(yùn)用Design Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸方程：Y=21.16+1.44X1+1.97X2-0.24X3+2.72X1X2-1.26X1X3+2.66X2X3-8.30X12-6.88X22-10.04X32

由表3可知，回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，相關(guān)系數(shù)R2=0.945 8，說(shuō)明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，其校正決定系數(shù)Radj=0.876 2，表明有約88.0%的酶活力變化能由該模型進(jìn)行解釋，說(shuō)明回歸模型的擬合程度很好，可以用來(lái)預(yù)測(cè)酶活?；貧w模型的P值＜0.000 1，模型顯著。

響應(yīng)面優(yōu)化得到液體發(fā)酵黑曲霉最佳產(chǎn)酶條件為接種量3.11%，初始pH值6.09，發(fā)酵時(shí)間60.02 h，由回歸方程預(yù)測(cè)酶活力為21.158 U/m L。根據(jù)回歸方程，得出不同因子的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖4。

表2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results Box-Behnken experiments

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiments design

圖4 接種量、發(fā)酵時(shí)間和pH值對(duì)酶活交互影響的曲面圖和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of the effects of interactions of inoculum,fermentation time and pH on enzyme activity

由圖4可知，接種量與初始pH值之間、接種量與發(fā)酵時(shí)間之間、初始pH值與發(fā)酵時(shí)間之間的相互作用顯著。響應(yīng)值（β-葡聚糖酶活力）存在最大值，各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，相互作用顯著，而且能清晰地看到最高點(diǎn)。

在上述響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下進(jìn)行液體發(fā)酵重復(fù)試驗(yàn)3次，發(fā)現(xiàn)所測(cè)實(shí)驗(yàn)值為20.03 U/m L，與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好，模型較好地反映黑曲霉高產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件工藝，優(yōu)化模型可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑曲霉HS-5發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化分析，得到發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的最佳發(fā)酵工藝條件：接種量為3.11%，初始pH值為6.09，發(fā)酵時(shí)間為60.02 h。在此最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得β-葡聚糖酶的酶活力為20.03 U/m L。通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，使最終酶活力比初始酶活（12.98 U/m L）提高了154%。

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Optimization of β-glucanase fermentation conditions by Aspergillus niger HS-5

WU Peng,WANG Zhilong,WU Xiu
(Hubei Key Laboratory of Econom ic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Co llege of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huanggang 438000,China)

The β-glucanase activity was determined by DNS method,and the optimal β-glucanase fermentation conditions by Aspergillus niger HS-5 was optimized.On the basis of single factor experiment,the technology conditions were optimized by central composite design and response surface methodology.The results showed that the optimal conditions were inoculum 3.11%,fermentation medium initial pH 6.09,and culture time 60.02 h. Under the optimal fermentation conditions,the β-glucanase activity was up to 20.03 U/m l,which was increased by 154%comparing to the initial activity of 12.98 U/m l.

A spergillus niger;β-glucanase;optimization;response surface methodology

TQ925

A

0254-5071（2015）03-0054-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.012

2015-02-26

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013CFB472）

吳鵬（1982-），女，講師，博士，研究方向食品生物技術(shù)和農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。