向 宇，李宗明，李佳萍，劉國平，李長春，李新云，趙書紅

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

恩施黑豬血液指標測定分析及和CXCR4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析

向 宇1，李宗明2，李佳萍1，劉國平2，李長春1，李新云1，趙書紅1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

為了解探究恩施黑豬這一地方豬種的免疫特性，采集了湖北某豬場的218頭免疫系統(tǒng)成熟的純種恩施黑豬，測定了24項血液五分類指標并與農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室對其他中外豬種的血液參數(shù)值進行了分析比較；對免疫候選基因CXCR4進行了多態(tài)性分析并發(fā)現(xiàn)SNP位點g542.C＞T和部分血液指標顯著關(guān)聯(lián)，為恩施黑豬的抗病育種提供了潛在的分子標記。

恩施黑豬；血液指標；CXCR4；關(guān)聯(lián)分析；分子標記

恩施黑豬是原產(chǎn)自湖北省西南部恩施自治州的地方優(yōu)良豬種，具有良好的抗逆性和抗病力。目前對于恩施黑豬這一地方豬種的血液指標研究不多，大部分集中在對其生產(chǎn)性能和胴體品質(zhì)等方面的開發(fā)利用，尚未見對其免疫候選基因分子標記的發(fā)掘。本試驗希望通過對黑豬血液指標的測定和分析，結(jié)合免疫候選基因SNP位點的篩選，為恩施黑豬的選育提供支持。

1??材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗材料樣品來自于湖北省某豬場的218頭純種恩施黑豬，按照統(tǒng)一標準進行飼養(yǎng)，日齡在五月齡以上，免疫系統(tǒng)均已成熟且健康狀況良好，執(zhí)行統(tǒng)一的免疫程序，健康狀況良好。

1.2 血液采集和血液指標的測定

用繩套或保定器套住恩施黑豬上頜部，自然保定，將一次性靜脈采血針穿刺針頭插入黑豬耳靜脈，通過透明硅膠軟管將另一頭接入帶抗凝劑EDTANa2的真空負壓抗凝管中，待血液至5 mL刻度處拔出穿刺針頭，待軟管內(nèi)血液流入負壓管內(nèi)拔出管塞穿刺針頭，輕微顛倒試管以便血液和抗凝劑重復(fù)混勻，放置于4 ℃短暫保存。

4 h內(nèi)將血樣用BC-5800全自動血液分析儀進行血液五分類檢測，上機檢測前需再次搖勻。采血時間統(tǒng)一在涼爽的早晨豬只尚未進食之前，便于減少豬只應(yīng)激和保持血液指標的穩(wěn)定。

血液五分類檢測的數(shù)據(jù)包括24項參數(shù)指標：白細胞數(shù)(WBC)、紅細胞數(shù)(RBC)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞分布寬度標準差（RDW-SD）、紅細胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、血紅蛋白(HGB)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、大型血小板比率(P-LCR)、中性細胞比率(NEUT%)、淋巴細胞比率(LYMPH%)、單核細胞比率(MONO%)、嗜酸性粒細胞比率(EO%)、嗜堿性粒細胞比率(BASO%)、中性細胞數(shù)(NEUT#)、淋巴細胞數(shù)(LYMPH#)、單核細胞數(shù)(MONO#)、嗜酸性細胞數(shù)(EO#)、嗜堿性細胞數(shù)(BASO#)。

1.3 數(shù)據(jù)分析比較

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析所有血液指標，計算血液指標的平均值、中值、標準差，與中國其他地方豬種及外來引進豬種的相同血液指標進行分析比較。其他中外豬種的血液指標來自文獻報道：杜洛克、大白豬、二花臉[1]、通城豬[2]。

1.4 DNA提取，CXCR4基因擴增和表型關(guān)聯(lián)分析

保定恩施黑豬，讀取耳號或耳牌記錄個體信息，用耳號鉗夾取恩施黑豬耳組織，剪下的耳組織樣用鑷子裝入2 mL EP管中，采用天根生化科技有限公司血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱型），按照說明書步驟提取。提取DNA后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和濃度測定。

根據(jù)已報導(dǎo)的文獻和本實驗室前期工作，用Primer 5設(shè)計了CXCR4基因外顯子區(qū)域的3對引物送上海生工公司合成，引物信息如表1所示。

PCR反應(yīng)體系為總體系10 μL，包括PCR Mix 5 μL，正向引物和反向引物各0.3 μL，DNA模板1 μL（50 ng/μL），ddH2O 3.4 μL。

PCR反應(yīng)過程為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度（52～57 ℃）40 s，72 ℃延伸40 s，重復(fù)35個循環(huán)，最后72 ℃5 min，低溫4 ℃保存。

2??結(jié)果

2.1 恩施黑豬血液五分類指標測定結(jié)果

恩施黑豬血液五分類指標測定結(jié)果如表2所示。之前相關(guān)文獻統(tǒng)計的地方豬種的血液五分類指標，白細胞數(shù)（WBC）參考范圍為10.73～33.13，紅細胞（RBC）參考范圍為5.15～8.12，血紅蛋白（HGB）參考范圍為96.03～177.52，血小板（PLT）參考范圍為172.61～443.88[3-5]。本次五分類測定的平均結(jié)果基本處于參考范圍之內(nèi)，但部分極值超出了參考范圍。

2.2 恩施黑豬血液指標相關(guān)分析結(jié)果

對恩施黑豬血液指標進行相關(guān)分析，結(jié)果如圖1所示。白細胞五分類中每類型的細胞即淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞的數(shù)目與自身細胞比率存在極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)分別為0.691，0.839，0.903，0.769和0.929。白細胞數(shù)目和淋巴細胞比率、嗜酸性粒細胞比率、嗜堿性粒細胞比率、紅細胞數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞平均體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白量濃度均存在顯著的負相關(guān)（P＜0.05），而和中性粒細胞比率、中性粒細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、單核細胞數(shù)存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05）。淋巴細胞比率和中性粒細胞比率存在顯著的負相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.7，中性粒細胞比率和其他幾種白細胞比率同樣存在顯著的負相關(guān)（P＜0.05）。此外紅細胞和血紅蛋白、紅細胞壓積間存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05），血紅蛋白與紅細胞壓積間也存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；平均血紅蛋白量和紅細胞平均體積間同樣存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05），平均血小板體積和大型血小板比率間存在極顯著的正相關(guān)（P＜0.01）血小板分布寬度與血小板及血小板壓積存在顯著的負相關(guān)（P＜0.05）。

表1 候選基因CXCR4引物信息

表2 恩施黑豬血液免疫指標總體統(tǒng)計

圖1 血液指標間的相關(guān)系數(shù)

2.3 恩施黑豬和其他豬種血液指標比較結(jié)果

將恩施黑豬和其他中外豬種相同的血液指標進行方差分析，結(jié)果恩施黑豬在WBC、RBC、HCT、MCV、HGB、LYMPH%、LYMPH#指標上均顯著高于大白豬群體和杜洛克群體，在MCH、MCHC、PLT、PCT指標上顯著高于二花臉群體。在紅細胞和白細胞數(shù)目上與通城豬無顯著差異。

2.4 CXCR4基因SNP位點和血液指標關(guān)聯(lián)結(jié)果

采集恩施黑豬耳樣提取DNA，隨機選取10個恩施黑豬基因組DNA混合成的DNA pool，根據(jù)設(shè)計的引物進行PCR擴增。將擴增PCR原液送公司測序，使用Seqman對峰圖進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CXCR4基因第2外顯子上發(fā)現(xiàn)一個g.542 C＞T的SNP位點。通過直接測序法進行基因分型，將該位點分型結(jié)果和血液指標進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表所示。該位點和WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT顯 著 關(guān) 聯(lián)（P＜0.05）。 其 中CC基因型個體的WBC、NEUT%、NEUT#、PCT均值顯著高于其他型個體（P＜0.05），TC基因型個體的LYMPH%、LYMPH#、PLT、PCT均值顯著高于其他型個體（P＜0.05），MONO%、HGB均值顯著低于其他型個體。

表3 CXCR4基因SNPg.542C＞T與表型性狀的關(guān)聯(lián)

3??討論

血液指標特別是五分類指標能有效反映機體的免疫狀態(tài)，從生理角度來說，血紅蛋白本身是紅細胞中的唯一非膜蛋白，由尚未成熟的紅細胞核糖體產(chǎn)生，兩者在數(shù)量上呈現(xiàn)顯著相關(guān)性；本次五分類測定中，這兩者的均值處在參考范圍里的較高，白細胞和中性細胞數(shù)、中性細胞比率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，可能是骨髓干細胞分化的白細胞中，中性粒細胞壽命最短，骨髓造血能力大部分用于中性粒細胞的供給，機體正常水平時中性粒細胞和白細胞數(shù)目變化趨勢呈現(xiàn)一致的一種體現(xiàn)[4]。和免疫功能有關(guān)的大部分細胞如淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞和嗜堿性粒細胞均存在不同程度的相關(guān)，表示機體的免疫系統(tǒng)是一個相互作用復(fù)雜的整體。在臨床上部分血液指標的急劇升高或降低可以作為產(chǎn)生疾病的征兆，但仍需要具體的抗原檢測。總之，了解血液指標的正常范圍波動和不同指標間的相關(guān)性有利于我們把握畜群的健康狀態(tài)。

在中外豬種的血液指標比較中發(fā)現(xiàn)，恩施黑豬與杜洛克、大白豬這類引入品種在多項指標上均存在顯著差異，而與二花臉、通城豬這類中國地方豬種在紅細胞、白細胞數(shù)目上無顯著差異；這充分表明了中國地方豬種和國外引入品種在免疫性狀上的差異同樣體現(xiàn)在不同類型的血細胞數(shù)目上。之前有研究表明，中外豬種的免疫細胞數(shù)目存在顯著性差異，例如梅山豬和大白豬的單核細胞及中性粒細胞[5]。而中國地方豬種內(nèi)部血液指標的差異則主要集中在血紅蛋白和紅細胞分布上，這可能與不同地方豬種分布的不同區(qū)域和環(huán)境有關(guān)，同時也要考慮個體和品種之間的差異對不同血液指標的影響。

通過候選基因法發(fā)現(xiàn)了CXCR4基因第二外顯子上發(fā)現(xiàn)一個g.542 C＞T的SNP位點與WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。CXCR4基因是趨化因子受體家族成員之一，趨化因子受體4又被稱為融合素、CD184。CXCR4的天然配體是基質(zhì)細胞衍生因子CXCR12，兩者相互作用形成的CXCR4/SDF-1生物學(xué)軸在參與細胞遷移、胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移與增殖、免疫調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等眾多生理病理過程都有著重要的意義[6]。已有研究也證實在CXCR4基因缺失的小鼠體內(nèi)B細胞前體細胞減少，而在血液中卻明顯增加。骨髓內(nèi)顆粒細胞也減少，但在血液中未成熟顆粒細胞明顯增加[7]。同樣有研究表示，CXCR4基因的不同SNP單倍型和HIV病毒、霍金奇淋巴癌、白血病感染等血液疾病和腫瘤感染有顯著相關(guān)，而且影響了感染后的白細胞數(shù)目變化及白細胞遷移情況。

因此，發(fā)現(xiàn)的CXCR4基因該SNP位點可能用于探究血液指標變化，作為恩施黑豬免疫候選分子標記應(yīng)用于該品種的選育。

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2015-06-23）

湖北省重大科技創(chuàng)新計劃產(chǎn)業(yè)化項目（2014ABC012）、湖北省杰出青年基金（2014CFA024）和教育部科技學(xué)技術(shù)項目（113048A）