周文兵，張 艷，俞向前，葉承榮，張 峻，朱建國(guó)

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2.上海市浦東新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201299;3.閔行區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201109）

浦東白豬Nramp1基因第6內(nèi)含子獨(dú)特突變位點(diǎn)分析

周文兵1，張 艷1，俞向前2，葉承榮2，張 峻3，朱建國(guó)2

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2.上海市浦東新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201299;3.閔行區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201109）

Nramp1是學(xué)術(shù)界近年研究的豬重要抗病基因之一，其第6內(nèi)含子作為Nramp1的分型重點(diǎn)片段，國(guó)內(nèi)外的諸多豬種均有清晰的測(cè)序分析結(jié)果。本研究通過(guò)提取浦東白豬血液組織DNA，使用PCR技術(shù)分離和克隆Nramp1基因的第6內(nèi)含子基因片段，測(cè)序后與以往文獻(xiàn)中的其他豬種進(jìn)行比較。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浦東白豬在該段基因中有3個(gè)特異的突變點(diǎn)普遍存在，分別是259 bp的A→G突變，331 bp的G→A突變和29 bp后1～2個(gè)T堿基的插入。這些突變的發(fā)現(xiàn)可以為浦東白豬的育種和Nramp1的抗病性研究提供遺傳數(shù)據(jù)。

浦東白豬；Nramp1基因；第6內(nèi)含子；PCR；基因突變

浦東白豬作為上海市特有的地方豬種，具有繁殖率高，性成熟早，閹割后，安靜少動(dòng)，適合圈飼，肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)[1]，是我國(guó)寶貴的地方豬種資源中獨(dú)具特色的一個(gè)品種。隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，為了防治傳染性疾病所導(dǎo)致的藥物殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重。這個(gè)問(wèn)題既影響人們?nèi)罕姷慕】狄苍黾恿松a(chǎn)成本。養(yǎng)殖不同品種具有特異性抗病能力的豬種可以有效地降低傳染病在不同豬群間的傳播能力，最終將會(huì)降低豬的養(yǎng)殖成本和提高豬肉產(chǎn)品的質(zhì)量。Nramp(natural resistance associated macrophage protein)基因即天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因家族。該家族基因的初次發(fā)現(xiàn)是在20世紀(jì)70年代，Bradley[2]等人在小鼠上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)導(dǎo)致杜氏利什曼蟲（Leishmania donovani）易感性的等位基因，被命名為L(zhǎng)sh。后來(lái)其他科學(xué)家[3-4]又先后在小鼠身上找到了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）易感的等位基因，分別被命名為Ity和Bcg。接著在1982年，這3個(gè)等位基因被開(kāi)始證明在1號(hào)染色體上的同一位點(diǎn)[5-6]。借助基因技術(shù)的發(fā)展，在20世紀(jì)90年代Nramp最終被發(fā)現(xiàn)和命名[7]后，Lsh/Ity/Bcg均被歸入該家族。Nramp1基因也于次年第1個(gè)被完整克隆并定位[8]。Nramp1基因在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞器官的巨噬細(xì)胞（血液外周白細(xì)胞、脾臟、肺等）中表達(dá)，和動(dòng)物體對(duì)多種胞內(nèi)病原微生物的抵抗力相關(guān)[9]。由于Nramp1基因較為保守，成為近年受研究較為普遍的抗病基因之一。豬的Nramp1基因，已經(jīng)在國(guó)內(nèi)的諸多豬種上得到研究，而且研究的方向主要集中在第6內(nèi)含子的Nde I位點(diǎn)分型，國(guó)內(nèi)地方豬種中僅有貴州的香豬、糯谷豬和宗地花豬[10]以及黑龍江的民豬[11]被進(jìn)行過(guò)Nramp1基因第6內(nèi)含子的基因測(cè)序研究。

本研究采用PCR擴(kuò)增片段后基因測(cè)序的研究方法，對(duì)浦東白豬的Nramp1基因第6內(nèi)含子的核苷酸序列進(jìn)行研究分析，尋找在該片段浦東白豬相對(duì)其他豬種的遺傳特異性。本研究的結(jié)果將為未來(lái)浦東白豬抵抗胞內(nèi)病原微生物的能力研究提供遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)，對(duì)Nramp1基因的抗病能力研究也會(huì)產(chǎn)生積極的意義。

1??材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中采用從上海浦匯浦東白豬繁育有限公司豬場(chǎng)采集的浦東白豬血液樣本，使用購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司的全血基因組DNA快速提取試劑盒（溶液型），貨號(hào)：DP1101，提取DNA樣本，用DNA溶解液水化后保存于-20 ℃。

1.2 引物和試劑

參照文獻(xiàn)[12]中的引物設(shè)計(jì)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物設(shè)計(jì)如下：

F： 5’ GCCAGCTTCCACAGTCT CCAG 3’

R： 5’ GGGGGTACAAAGGGGAA GAAG 3’

引物用去離子水配置成100μM的貯存液，預(yù)期擴(kuò)增片段為483 bp。

1.3 全血基因組DNA快速提取

參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下：

1）將血液加入紅細(xì)胞裂解液中，使血液中的紅細(xì)胞完全裂解；

2）離心得到白細(xì)胞團(tuán)，利用細(xì)胞核裂解液釋放出白細(xì)胞的基因組DNA；

3）加入蛋白質(zhì)沉淀液，離心去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)；

4）異丙醇沉淀DNA；

5）用70%乙醇漂洗數(shù)次；

6）晾干后加入DNA溶解液水化。

1.4 PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序

PCR反應(yīng)總體系25 μl，組分為：Mix，12.5 μl； Dna模板，3 μl；上下游引物，各1 μl；去離子水，7.5 μl。

PCR運(yùn)行程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 S，64 ℃ 45 S，72 ℃45 S，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶純化回收，將回收的產(chǎn)物經(jīng)E.coliDH5α Competent細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。PCR產(chǎn)物電泳，純化回收和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中的主要試劑均購(gòu)自Takara公司。

2??結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的產(chǎn)物均為483 bp左右，與預(yù)期片段相符。

圖1 浦東白豬Nramp1基因第6內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 擴(kuò)增結(jié)果片段基因測(cè)序

選取10個(gè)條帶清晰的目的條帶片段，從瓊脂凝膠中回收，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后進(jìn)行全序列基因測(cè)序。基因測(cè)序的結(jié)果與Gen Bank Nramp1（登陸號(hào)：AY368473）的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)與 AY368473 不同的突變點(diǎn)。突變結(jié)果剪輯如圖2、3、4所示，其中AY368473.1為從Genbank選取的基因序列，1-10為選取的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因序列。浦東白豬的Nramp1基因第6內(nèi)含子在331位點(diǎn)出現(xiàn)G→A突變；在259位點(diǎn)出現(xiàn)A→G突變；29位點(diǎn)之后插入了1～2個(gè)T堿基。

圖2 Nramp1第6內(nèi)含子基因序列比較結(jié)果1

圖3 Nramp1第6內(nèi)含子基因序列比較結(jié)果2

圖4 Nramp1第6內(nèi)含子基因序列比較結(jié)果3

2??討論

近年國(guó)內(nèi)外豬種的Nramp1基因多態(tài)性的研究大多集中在第6內(nèi)含子，尤其圍繞在111 bp位點(diǎn)的C→A突變。自吳宏梅等[12]首次發(fā)現(xiàn)該突變?cè)诖蟀棕i和松遼黑豬2個(gè)豬種上有相反的抗病能力表現(xiàn)后，楊軍等[13]、趙生國(guó)等[14]以及劉艷冬[10]分別在不同的中外豬種發(fā)現(xiàn)了該突變，并證實(shí)了該突變可導(dǎo)致抗病力的差異表現(xiàn)。Nramp1基因作為抗病基因，的確具有重要的研究?jī)r(jià)值?？上г撏蛔兾稽c(diǎn)發(fā)生作用的機(jī)理，至今尚未有較為確切的合理解釋。我國(guó)具有廣大的地域，地理上的分割促使了很多地方豬種的獨(dú)立培育。對(duì)這些地方豬種的第6內(nèi)含子基因序列進(jìn)行更廣泛的基因?qū)W研究，或許可以找到更多的可致Nramp1基因抗病性改變的基因突變，這將有助于對(duì)該現(xiàn)象的解釋，也將對(duì)Nramp1基因的抗病機(jī)理研究頗有裨益。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR方法分離和克隆浦東白豬的Nramp1基因第6內(nèi)含子片段，在采用基因測(cè)序方法來(lái)檢測(cè)完該片段后，尋找浦東白豬在該片段中特有的突變位點(diǎn)。結(jié)果顯示浦東白豬的該片段與國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得到研究的諸多豬種相比具有很高的品種特異性。研究中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)突變位點(diǎn)，既不同于迄今唯一被發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生抗病力差異的111 bp位點(diǎn)突變，與羅文華[15]從4種中外豬種發(fā)現(xiàn)的5個(gè)突變位點(diǎn)和李娟娟[16]等人從合作豬發(fā)現(xiàn)的10個(gè)突變位點(diǎn)也沒(méi)有重復(fù)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明了浦東白豬在Nramp1抗病基因的遺傳獨(dú)特性，浦東白豬在抗病基因的研究中將可能具有非常重要的作用。如果未來(lái)對(duì)浦東白豬繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)基因抗病性的基因?qū)W和免疫學(xué)研究，會(huì)對(duì)抗病豬種的培育產(chǎn)生難以預(yù)料的幫助。

近20年來(lái)隨著國(guó)外豬種的大量引入，國(guó)內(nèi)地方豬種的分布范圍嚴(yán)重減小，種群數(shù)量急劇下降，部分種群中一些低頻率的基因突變位點(diǎn)可能因此而喪失。特別在一些群體基數(shù)異常小的豬群，該現(xiàn)象會(huì)更加突出。這一方面將使很多地方豬種的遺傳特異性更加突出，另一方面也可能會(huì)導(dǎo)致該豬種群體中特有的部分遺傳特性永遠(yuǎn)喪失，成為遺傳資源的重大損失。利用基因技術(shù)對(duì)現(xiàn)存地方豬種進(jìn)行廣泛的抗病基因?qū)W研究，將能夠?yàn)楸Ｗo(hù)地方豬種遺傳資源產(chǎn)生重要的作用。

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2015-06-04）

上海市種業(yè)發(fā)展項(xiàng)目地方畜禽遺傳資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究和示范及上海市生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目

周文兵，男，江蘇省宿遷市人，碩士研究生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)

朱建國(guó),email: zhu_jg@sjtu.edu.cn