(黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學(xué)院養(yǎng)殖系，黑龍江 牡丹江 157041)

黑龍江省東部地區(qū)PRRSV流行毒株NSP2基因序列分析

李曉娟，李樹東

(黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學(xué)院養(yǎng)殖系，黑龍江 牡丹江 157041)

為了解黑龍江省東部地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的流行毒株遺傳變異情況，對該地區(qū)疑似藍(lán)耳病的發(fā)病豬進行剖檢，采集病料，提取RNA，利用RT-PCR方法進行擴增，成功分離到1株P(guān)RRSV毒株，并對其NSP2序列進行測定和序列比對分析。序列分析表明，該分離株具有30個氨基酸缺失的基因特征，利用DNAstar軟件進一步分析表明，本分離株與其他毒株國內(nèi)分離株同源性在97.9%～98.9%之間，與經(jīng)典毒株親緣性較差。系統(tǒng)發(fā)生進化樹可以看出本次擴增PRRS毒株與國內(nèi)廣東分離株親源關(guān)系最近，同屬一個小分支。試驗分離得到1株P(guān)RRS變異毒株，為分析掌握該地區(qū)的藍(lán)耳病的遺傳變異、流行動態(tài)及防控奠定基礎(chǔ)。

藍(lán)耳病病毒；NSP2基因；序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）于1987年首次在美國發(fā)現(xiàn)[1]，此后廣泛存在于世界各國和地區(qū)。我國1996年首次分離到該病毒[2]，2006年夏秋之季，由于藍(lán)耳病病毒的致病毒力發(fā)生變化，導(dǎo)致我國部分地區(qū)發(fā)生高致病性豬藍(lán)耳病疫情，先后波及到多個省份。但由于當(dāng)時沒有有效的預(yù)防和治療的手段，生豬發(fā)病死亡率比較高，有超過1 000萬頭豬在這場疫病暴發(fā)中死亡和被銷毀，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。高致病性豬藍(lán)耳病疫情帶給我們的經(jīng)驗教訓(xùn)是早期預(yù)警預(yù)測、實驗室檢測等意義重大，因此對于藍(lán)耳病的流行感染情況和毒株的變異情況進行監(jiān)測，是預(yù)防和控制該病最有效的方法。了解藍(lán)耳病流行感染狀態(tài)，分析流行的優(yōu)勢毒株，有針對性地合理應(yīng)用疫苗，對進一步更好地防控該病具有深遠(yuǎn)的意義。

1??材料與方法

1．1 病料來源

采取經(jīng)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒RT-PCR診斷試劑盒檢測陽性的死豬扁桃體、血清、肺臟組織。

1．2 試劑材料

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DEPC水、DL2 000 Marker、總DNA抽 提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒均購自上海生工生物有限公司，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(RevertAidTm M-MuLV Reverse Transcriptase)、RNA酶抑制劑(Ribonuclease inhibitor)購自MBI Fermentas公司，Agarose瓊脂糖購自美國基因泰克公司，豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR診斷試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1．3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表PRRSV-NSP2（豬藍(lán)耳病NSP2基因）用Oligo6.0軟件設(shè)計引物，引物基因序列[3]，預(yù)期擴增長度為795 bp：

NSP2-F1：5'-CAA CAC CCA GGC GAC TTC AGA AAT G-3'；

NSP2-R1：5'-CA AGT CAG CAT GTC AAC CCTATC-3'

1．4 病料處理

1）組織樣品處理：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1 g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清液100 μL于1.5 mL滅菌離心管中。2）全血樣品處理：待血凝后取血清100 μL，置1.5 mL滅菌離心管中。

1．5 病毒 RNA 的提取

1）取已處理的樣品加入裂解液 600 μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5 min。 2）將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），13 000 r/min離心30 s。3） 棄去收集管中液體，加入600 μL洗液，13 000 r/min離心30 s。 4） 重復(fù)步驟3）。5） 棄去收集管中液體，13 000 r/min空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。6）將吸附柱移入新的1.5 mL離心管中，向柱中央加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min，13 000 r/min離心30 s，離心管中液體即為模板RNA。

1．6 擴增Nsp2基因

將樣品提取的RNA再次進行RTPCR反應(yīng)，擴增Nsp2基因。20μL反轉(zhuǎn)錄體系：2μL模板RNA， 2μL引物Nsp2-R，70 ℃水浴5 min，冰上 2 min； 加 入 4μL 5×reverse transcription reaction buffer，8μL2.5 mmol/L dNTP，1μL Ribonuclease inhibitor(20U)， 滅菌去離子水2μL，混勻，37 ℃水浴5 min；加入1μL (200U) MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，混勻，42 ℃水浴2 h；70 ℃水浴10 min終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下：l0×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol/ L dNTP 2μL，引物1μL (上下游引物各0.5μL)，cDNA 1μL，rTaqDNA聚合酶0.25μL，補水至25μL。95 ℃預(yù)變性 5 min；然后94 ℃1 min、59 ℃40 s、72 ℃50 s，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。所擴增的片段理論大小約為795 bp。按膠回收試劑盒說明書回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物目的片段送生物公司進行序列測定。

1．7 序列分析

應(yīng)用 DNAStar軟件將分離株的NSP2序列與已公布的參考毒株序列進行比對分析，分析基因同源性并繪制系統(tǒng)進化樹。

2??結(jié)果與分析

2．1 NSP2基因擴增結(jié)果

應(yīng)用設(shè)計引物對NSP2基因進行擴增，可見到795 bp左右的基因條帶，大小與預(yù)期基因相符（圖1）。

2．2 測序與核苷酸比對結(jié)果

將NSP2基因回收送基因測序公司進行測序，結(jié)果得到795 bp的序列，命名為MDJ-1測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典毒株相比有90堿基的缺失，符合基因缺失型豬藍(lán)耳病的特征，結(jié)果如圖2。

2．3 核苷酸同源性比較結(jié)果

測序結(jié)果表明，本研究成功地從送檢病料中擴增出本地區(qū)PRRS病毒Nsp2基因，利用DNAstar軟件進一步分析表明，本分離株與其他毒株國內(nèi)分離株同源性在97.9%～98.9%之間，與經(jīng)典毒株親緣性較差。

從系統(tǒng)發(fā)生進化樹可以看出本次擴增PRRS毒株與國內(nèi)廣東分離株親源關(guān)系最近，同屬一個小分支，并且同屬于Nsp2基因缺失型藍(lán)耳病病毒。

3??討論

圖1 Nsp2基因擴增結(jié)果

圖2 本分離株與其他PRRS毒株的核苷酸序列比對

圖3 本分離株與其他PRRS毒株的核苷酸同源性比較

圖4 Nsp2基因系統(tǒng)進化樹結(jié)構(gòu)圖

PRRSV為單股正鏈RNA病毒，是變異率較高的RNA病毒，基因組長約15 kb，含有9個開放閱讀框，線性排列順序為5′-ORF1a/1b-ORF2-Gp3-Gp4-Gp5-M-N-3′，病毒基因組的每個讀碼框都和相鄰的有部分重疊[4]。PRRSV最主要的非結(jié)構(gòu)蛋白是Nsp2，具有3C樣半胱氨酸蛋白酶區(qū)域，該區(qū)域的功能是Nsp2蛋白研究的熱點。Nsp2蛋白編碼區(qū)氨基酸序列具有很高的變異性，但不論是歐洲株還是北美株的Nsp2蛋白都包含大量線性B細(xì)胞抗原決定簇，表明Nsp2蛋白是機體感染PRRSV后能夠引起機體抗體應(yīng)答的免疫活性蛋白，同時Nsp2蛋白具有細(xì)胞和組織嗜性，與病毒的復(fù)制復(fù)合體的形成有關(guān)。ORF1a中的NSP2基因是PRRSV高變基因之一。有研究表明NSP2基因突變與缺失可能影響病毒對組織和細(xì)胞的嗜性，也可能與病毒感染有關(guān)。2006年暴發(fā)的高致病性豬藍(lán)耳病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，NSP2基因存在不連續(xù)的30個氨基酸的缺失為基因特征，因而推測該30個氨基酸的缺失可能是引起毒力增強的原因。而有研究表明，30個氨基酸的缺失與其毒力增強無關(guān)。本試驗成功擴增到1 株毒株P(guān)RRS-NSP2基因，應(yīng)用 DNAStar 軟件對分離的毒株和參考毒株進行了序列比對分析，結(jié)果表明，分離株具有基因缺失的特征，另外也存在有散在不規(guī)律的堿基和氨基酸的突變，證明本地區(qū)仍然存在藍(lán)耳病的流行。

[1] Bilodeau R， Dea S， Sauvageau R A， et al.‘Porcine reproductive and respiratory syndrome’in Quebec[J]. Vet Rec. 1991，129(5)： 102-103.

[2] 夏偉，袁遠(yuǎn)，張宇輝，等.高致病性藍(lán)耳病臨床案例分析與防治策略[J].養(yǎng)豬，2014（4）：89.

[3] 孫明，涂長春，李紅衛(wèi)，等.應(yīng)用多聯(lián)PCR對引發(fā)豬繁殖障礙有關(guān)病毒的檢測I.JEV、PPV、PRRSV、PRV多聯(lián)PCR引物設(shè)計[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20（1）：10-14.

[4] 樸明淑，蔡錦順，魯承，等.豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒延邊地區(qū)地方株的分離鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：208-210.

2014-12-29）

黑龍江省教育廳高職高專科學(xué)研究項目，“黑龍江省東部地區(qū)豬藍(lán)耳病動態(tài)研究”項目編號：12525074

李曉娟，女，漢族，講師，碩士研究生，出生年月1982年1月。研究方向：分子免疫學(xué)