(黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院養(yǎng)殖系,黑龍江 牡丹江 157041)
黑龍江省東部地區(qū)PRRSV流行毒株NSP2基因序列分析
李曉娟,李樹東
(黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院養(yǎng)殖系,黑龍江 牡丹江 157041)
為了解黑龍江省東部地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的流行毒株遺傳變異情況,對(duì)該地區(qū)疑似藍(lán)耳病的發(fā)病豬進(jìn)行剖檢,采集病料,提取RNA,利用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,成功分離到1株P(guān)RRSV毒株,并對(duì)其NSP2序列進(jìn)行測(cè)定和序列比對(duì)分析。序列分析表明,該分離株具有30個(gè)氨基酸缺失的基因特征,利用DNAstar軟件進(jìn)一步分析表明,本分離株與其他毒株國(guó)內(nèi)分離株同源性在97.9%~98.9%之間,與經(jīng)典毒株親緣性較差。系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹可以看出本次擴(kuò)增PRRS毒株與國(guó)內(nèi)廣東分離株親源關(guān)系最近,同屬一個(gè)小分支。試驗(yàn)分離得到1株P(guān)RRS變異毒株,為分析掌握該地區(qū)的藍(lán)耳病的遺傳變異、流行動(dòng)態(tài)及防控奠定基礎(chǔ)。
藍(lán)耳病病毒;NSP2基因;序列分析
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)于1987年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)[1],此后廣泛存在于世界各國(guó)和地區(qū)。我國(guó)1996年首次分離到該病毒[2],2006年夏秋之季,由于藍(lán)耳病病毒的致病毒力發(fā)生變化,導(dǎo)致我國(guó)部分地區(qū)發(fā)生高致病性豬藍(lán)耳病疫情,先后波及到多個(gè)省份。但由于當(dāng)時(shí)沒有有效的預(yù)防和治療的手段,生豬發(fā)病死亡率比較高,有超過1 000萬頭豬在這場(chǎng)疫病暴發(fā)中死亡和被銷毀,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。高致病性豬藍(lán)耳病疫情帶給我們的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)是早期預(yù)警預(yù)測(cè)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等意義重大,因此對(duì)于藍(lán)耳病的流行感染情況和毒株的變異情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),是預(yù)防和控制該病最有效的方法。了解藍(lán)耳病流行感染狀態(tài),分析流行的優(yōu)勢(shì)毒株,有針對(duì)性地合理應(yīng)用疫苗,對(duì)進(jìn)一步更好地防控該病具有深遠(yuǎn)的意義。
1.1 病料來源
采取經(jīng)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒RT-PCR診斷試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性的死豬扁桃體、血清、肺臟組織。
1.2 試劑材料
Taq DNA聚合酶、dNTPs、DEPC水、DL2 000 Marker、總DNA抽 提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工生物有限公司,鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(RevertAidTm M-MuLV Reverse Transcriptase)、RNA酶抑制劑(Ribonuclease inhibitor)購(gòu)自MBI Fermentas公司,Agarose瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)基因泰克公司,豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR診斷試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。
1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank發(fā)表PRRSV-NSP2(豬藍(lán)耳病NSP2基因)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物基因序列[3],預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為795 bp:
NSP2-F1:5'-CAA CAC CCA GGC GAC TTC AGA AAT G-3';
NSP2-R1:5'-CA AGT CAG CAT GTC AAC CCTATC-3'
1.4 病料處理
1)組織樣品處理:每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱取樣品約1 g,用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g于研磨器中研磨,加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL滅菌離心管中,8 000 r/min離心2 min,取上清液100 μL于1.5 mL滅菌離心管中。2)全血樣品處理:待血凝后取血清100 μL,置1.5 mL滅菌離心管中。
1.5 病毒 RNA 的提取
1)取已處理的樣品加入裂解液 600 μL,充分顛倒混勻,室溫靜置3~5 min。 2)將液體吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管,吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),以免離心時(shí)堵塞吸附柱),13 000 r/min離心30 s。3) 棄去收集管中液體,加入600 μL洗液,13 000 r/min離心30 s。 4) 重復(fù)步驟3)。5) 棄去收集管中液體,13 000 r/min空柱離心 2 min,以除去殘留的洗滌液。6)將吸附柱移入新的1.5 mL離心管中,向柱中央加入洗脫液50 μL,室溫靜置1 min,13 000 r/min離心30 s,離心管中液體即為模板RNA。
1.6 擴(kuò)增Nsp2基因
將樣品提取的RNA再次進(jìn)行RTPCR反應(yīng),擴(kuò)增Nsp2基因。20μL反轉(zhuǎn)錄體系:2μL模板RNA, 2μL引物Nsp2-R,70 ℃水浴5 min,冰上 2 min; 加 入 4μL 5×reverse transcription reaction buffer,8μL2.5 mmol/L dNTP,1μL Ribonuclease inhibitor(20U), 滅菌去離子水2μL,混勻,37 ℃水浴5 min;加入1μL (200U) MuLV反轉(zhuǎn)錄酶,混勻,42 ℃水浴2 h;70 ℃水浴10 min終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下:l0×PCR Buffer 2.5μL,2.5 mmol/ L dNTP 2μL,引物1μL (上下游引物各0.5μL),cDNA 1μL,rTaqDNA聚合酶0.25μL,補(bǔ)水至25μL。95 ℃預(yù)變性 5 min;然后94 ℃1 min、59 ℃40 s、72 ℃50 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。所擴(kuò)增的片段理論大小約為795 bp。按膠回收試劑盒說明書回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物目的片段送生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。
1.7 序列分析
應(yīng)用 DNAStar軟件將分離株的NSP2序列與已公布的參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析,分析基因同源性并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。
2.1 NSP2基因擴(kuò)增結(jié)果
應(yīng)用設(shè)計(jì)引物對(duì)NSP2基因進(jìn)行擴(kuò)增,可見到795 bp左右的基因條帶,大小與預(yù)期基因相符(圖1)。
2.2 測(cè)序與核苷酸比對(duì)結(jié)果
將NSP2基因回收送基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果得到795 bp的序列,命名為MDJ-1測(cè)序結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典毒株相比有90堿基的缺失,符合基因缺失型豬藍(lán)耳病的特征,結(jié)果如圖2。
2.3 核苷酸同源性比較結(jié)果
測(cè)序結(jié)果表明,本研究成功地從送檢病料中擴(kuò)增出本地區(qū)PRRS病毒Nsp2基因,利用DNAstar軟件進(jìn)一步分析表明,本分離株與其他毒株國(guó)內(nèi)分離株同源性在97.9%~98.9%之間,與經(jīng)典毒株親緣性較差。
從系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹可以看出本次擴(kuò)增PRRS毒株與國(guó)內(nèi)廣東分離株親源關(guān)系最近,同屬一個(gè)小分支,并且同屬于Nsp2基因缺失型藍(lán)耳病病毒。
圖1 Nsp2基因擴(kuò)增結(jié)果
圖2 本分離株與其他PRRS毒株的核苷酸序列比對(duì)
圖3 本分離株與其他PRRS毒株的核苷酸同源性比較
圖4 Nsp2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)圖
PRRSV為單股正鏈RNA病毒,是變異率較高的RNA病毒,基因組長(zhǎng)約15 kb,含有9個(gè)開放閱讀框,線性排列順序?yàn)?′-ORF1a/1b-ORF2-Gp3-Gp4-Gp5-M-N-3′,病毒基因組的每個(gè)讀碼框都和相鄰的有部分重疊[4]。PRRSV最主要的非結(jié)構(gòu)蛋白是Nsp2,具有3C樣半胱氨酸蛋白酶區(qū)域,該區(qū)域的功能是Nsp2蛋白研究的熱點(diǎn)。Nsp2蛋白編碼區(qū)氨基酸序列具有很高的變異性,但不論是歐洲株還是北美株的Nsp2蛋白都包含大量線性B細(xì)胞抗原決定簇,表明Nsp2蛋白是機(jī)體感染PRRSV后能夠引起機(jī)體抗體應(yīng)答的免疫活性蛋白,同時(shí)Nsp2蛋白具有細(xì)胞和組織嗜性,與病毒的復(fù)制復(fù)合體的形成有關(guān)。ORF1a中的NSP2基因是PRRSV高變基因之一。有研究表明NSP2基因突變與缺失可能影響病毒對(duì)組織和細(xì)胞的嗜性,也可能與病毒感染有關(guān)。2006年暴發(fā)的高致病性豬藍(lán)耳病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,NSP2基因存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸的缺失為基因特征,因而推測(cè)該30個(gè)氨基酸的缺失可能是引起毒力增強(qiáng)的原因。而有研究表明,30個(gè)氨基酸的缺失與其毒力增強(qiáng)無關(guān)。本試驗(yàn)成功擴(kuò)增到1 株毒株P(guān)RRS-NSP2基因,應(yīng)用 DNAStar 軟件對(duì)分離的毒株和參考毒株進(jìn)行了序列比對(duì)分析,結(jié)果表明,分離株具有基因缺失的特征,另外也存在有散在不規(guī)律的堿基和氨基酸的突變,證明本地區(qū)仍然存在藍(lán)耳病的流行。
[1] Bilodeau R, Dea S, Sauvageau R A, et al.‘Porcine reproductive and respiratory syndrome’in Quebec[J]. Vet Rec. 1991,129(5): 102-103.
[2] 夏偉,袁遠(yuǎn),張宇輝,等.高致病性藍(lán)耳病臨床案例分析與防治策略[J].養(yǎng)豬,2014(4):89.
[3] 孫明,涂長(zhǎng)春,李紅衛(wèi),等.應(yīng)用多聯(lián)PCR對(duì)引發(fā)豬繁殖障礙有關(guān)病毒的檢測(cè)I.JEV、PPV、PRRSV、PRV多聯(lián)PCR引物設(shè)計(jì)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000,20(1):10-14.
[4] 樸明淑,蔡錦順,魯承,等.豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒延邊地區(qū)地方株的分離鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(1):208-210.
2014-12-29)
黑龍江省教育廳高職高??茖W(xué)研究項(xiàng)目,“黑龍江省東部地區(qū)豬藍(lán)耳病動(dòng)態(tài)研究”項(xiàng)目編號(hào):12525074
李曉娟,女,漢族,講師,碩士研究生,出生年月1982年1月。研究方向:分子免疫學(xué)