張騰國，郭艷峰，陳瓊瓊，夏小慧

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.蘭州城市學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

油菜COR基因的克隆及原核表達(dá)

張騰國1，郭艷峰1，陳瓊瓊1，夏小慧2

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.蘭州城市學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

以冬油菜隴油6號葉片為材料，利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因編碼區(qū)序列，全長390 bp。將其與大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-COR，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明該基因表達(dá)了1個約14.3 kD的蛋白，為進(jìn)一步研究目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了實驗基礎(chǔ)。

隴油6號；COR基因；克??；原核表達(dá)

植物為了維持正常的生長和發(fā)育，需要不斷的感知和適應(yīng)外界環(huán)境的變化。低溫是主要的環(huán)境脅迫因素之一，當(dāng)受到低溫脅迫時，絕大多數(shù)植物需要經(jīng)過一段低溫馴化（cold acclimation）過程以獲得對低溫的耐受能力。在植物響應(yīng)低溫脅迫的馴化過程中，體內(nèi)發(fā)生著許多生理生化和分子變化［1］，包括細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的變化、新陳代謝過程的變化、基因表達(dá)水平的變化等［1～3］，其中以低溫激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄最為重要。擬南芥中受低溫調(diào)節(jié)的基因占到了基因組的4%～20%［4］，其中有一類低溫脅迫響應(yīng)基因COR（for cold responsive），其啟動子區(qū)有干旱反應(yīng)元件DRE/ CRT，擁有共同的核心基序（CCGAC）。擬南芥中有幾種COR基因（cold responsive genes），其中COR15a基因編碼一個Mr為15 000的多肽，轉(zhuǎn)基因研究表明，在-8～-4℃的范圍內(nèi)，含有COR15am的原生質(zhì)體比不含有COR15am的原生質(zhì)體更具有抗凍性，且COR15a的表達(dá)能增加原生質(zhì)膜的低溫穩(wěn)定性（cryostability）［5］。除了COR15a以外，還有COR66、COR47和COR78等低溫反應(yīng)基因。在低溫馴化期間，這幾個基因也能表達(dá)。COR15a與它們的協(xié)同表達(dá)可明顯提高植物的抗寒性［6］。

人們對COR基因協(xié)同表達(dá)進(jìn)行了大量的研究,發(fā)現(xiàn)了它們的轉(zhuǎn)錄激活因子CBF，Stockinger等從擬南芥中分離得到了能夠結(jié)合干旱反應(yīng)元件DRE/ CRT的轉(zhuǎn)錄因子DREB1/CBF［7］。CBF基因家族的3個成員可以被低溫脅迫短暫而迅速的誘導(dǎo)［8，9］，誘導(dǎo)的CBF轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到COR基因啟動子順式作用元件上，激活COR基因的表達(dá)。

從擬南芥中分離得到1個組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子ICE1（inducer of CBF expression 1），ICE1基因編碼類似MYC的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在低溫脅迫響應(yīng)途徑中，ICE1作為CBFs的上游因子，可特異地結(jié)合到CBF3啟動子的MYC作用元件，激活CBF3的表達(dá)并誘導(dǎo)CBF/DREB1下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。組成型過量表達(dá)ICE1可以增強(qiáng)低溫馴化過程中CBF3、CBF2以及COR基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的低溫耐受能力，ICE1突變體可以減弱低溫對CBF3及受CBFs轉(zhuǎn)錄因子控制的COR基因的誘導(dǎo)表達(dá)［4］。以上研究表明，由ICE1→CBF→COR組成的低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)在植物低溫馴化過程中發(fā)揮著重要的作用。

油菜是重要的油料作物，白菜型油菜（Brassica campestris.L）新品種隴油6號是一種超強(qiáng)抗寒性品種，適于極端低溫為-30～-20℃的旱區(qū)、寒區(qū)種植。本研究以隴油6號油菜為材料，克隆了ICE1→CBF→COR低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中的COR基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，以期為植物抵御低溫脅迫的作用機(jī)制補充新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

以隴油6號油菜為供試材料。將隴油6號油菜種子播種到含有混合營養(yǎng)土的小塑料盆內(nèi)，置于室溫條件下培養(yǎng)28 d左右，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱冷處理24h，剪取油菜葉片，直接用于RNA的提取。

原核表達(dá)載體pET30a由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存，克隆載體pTG19-T、T4 DNA連接酶購自于捷瑞公司，Premix Ex Taq DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶購自于TaKaRa公司，Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購自于全式金公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄選取生長良好的隴油6號油菜幼嫩葉片，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取，提取的RNA用PrimerScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司）合成cDNA。放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油菜COR基因編碼區(qū)的克隆根據(jù)本實驗室已擴(kuò)增得到的油菜COR基因CDS區(qū)設(shè)計引物，上游引物CORYHBD-U1：5’-TCCGAATTCATGGCTATGTCTTTCTC-3’（下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點），下游引物CORYHBD-D1∶5’-GGCGTCGACTCATGCCTTGTAGTGT-3’（下劃線序列為SalⅠ酶切位點）。以cDNA為模板，擴(kuò)增COR基因CDS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pTG19-T載體上，轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)PCR確認(rèn)后，送北京六合華大測序。

1.2.3 原核表達(dá)載體pET30a-COR的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，對測序正確的pTG19-T-COR重組載體和表達(dá)載體pET30a分別進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選后挑取白斑提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR與酶切驗證為陽性克隆后，送北京六合華大測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-COR。

1.2.4 含有重組表達(dá)質(zhì)粒大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)過序列分析的含有融合表達(dá)質(zhì)粒pET30a-COR的重組菌30 μL接種至3 mL含1%葡萄糖的LB培養(yǎng)液（含50 μg/mL Kan）中，37℃振搖過夜。取過夜培養(yǎng)物200 μL接種于20 mL含1%葡萄糖的LB培養(yǎng)液（含50 μg/mL Kan）中，劇烈振搖至OD600為0.6～1.0時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，5 h后收集2 mL菌液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，檢測表達(dá)產(chǎn)物。用轉(zhuǎn)化空白質(zhì)粒載體的大腸桿菌BL21作為陰性對照。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測收集的菌液以12 000 rpm離心5 min，菌體用無菌水吹懸，12 000 rpm離心，棄去上清液，用50 μL pH 7.4的PBS懸浮，加入等體積的2×SDS loading-buffer［100 mM Tris.c1（pH 8.0）、4%SDS、200 mM巰基乙醇、20%甘油、0.2%溴酚蘭］混勻，水浴煮沸5 min，用微量進(jìn)樣器上樣20 μL，打開電源，濃縮膠中用60 V電壓，電泳至溴酚蘭進(jìn)入分離膠，把電壓提高到100 V，繼續(xù)電泳至溴酚蘭到達(dá)凝膠底部。取下凝膠用蒸餾水沖洗，用凝膠5倍體積的考馬斯亮蘭染色液（45 mL甲醇∶45 mL水∶10 mL冰醋酸中溶解0.25 g考馬斯亮蘭）浸泡凝膠，放在平緩搖動的平臺上室溫染色1 h。用脫色液在脫色搖床上脫色，其間更換脫色液3～4次。待背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 隴油6號總RNA的提取

通過對實驗操作技術(shù)的不斷改進(jìn)，使用Trizol試劑從隴油6號油菜葉片中提取得到了高質(zhì)量的總RNA產(chǎn)物，樣品的28S和18S rRNA條帶清晰，無DNA和蛋白質(zhì)污染（圖1）。

圖1 油菜總RNA提取電泳圖

2.2 油菜COR基因CDS區(qū)的克隆

應(yīng)用特異引物CORYHBD-U1和CORYHBD-D1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了1條390 bp大小的單一條帶（圖2）。測序結(jié)果表明，該序列與已得到的油菜COR基因編碼區(qū)是完全一致的。測序結(jié)果如下：

圖2 油菜COR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

利用DNAStar軟件，將油菜COR基因與其他植物中克隆得到的響應(yīng)環(huán)境脅迫有關(guān)的COR基因編碼區(qū)（CDS序列）輸入MegAlign軟件，用Clustal方法進(jìn)行序列同源性比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：油菜COR與多種植物的COR基因有較高的同源性，與擬南芥AtCOR15B、白菜BrCOR15、薺菜CbCOR15a、油菜BnCOR115的同源性分別為74.6%、76.4%、71.1%、86.2%（圖3）。因此可以判斷，擴(kuò)增產(chǎn)物為油菜COR基因片段。

圖3 油菜COR基因與其他植物COR基因同源性

2.3 融合表達(dá)載體pET30a-COR的構(gòu)建與PCR鑒定

將重組質(zhì)粒pTG19-T-COR分別用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，得到目的基因片段，與同樣雙酶切處理的原核表達(dá)載體pET30a連接，得到融合表達(dá)載體pET30a-COR。構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，過夜培養(yǎng)，從過夜培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基中挑選白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶得到390 bp左右的片段（圖4），與預(yù)期的片段相符。測序結(jié)果表明，所測序列為油菜COR基因390 bp的正確閱讀框架，沒有移碼突變。該重組質(zhì)粒命名為pET30a-COR。

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-COR酶切分析

2.4 重組表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測

重組質(zhì)粒pET30a-COR經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE電泳（圖5）顯示，存在1條融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條帶，而誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體未出現(xiàn)目的蛋白帶。表明重組質(zhì)粒pET30a-COR在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)了油菜COR蛋白。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖

3 討論

1）冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平與CBF基因的表達(dá)水平有很大的線性關(guān)聯(lián)，CBF基因表達(dá)水平越高，冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平就越強(qiáng)［10］。CBF轉(zhuǎn)錄激活因子的AP2氨基酸序列能夠特異性的識別并結(jié)合COR基因啟動子中的CRT/DRE元件，調(diào)控植物體內(nèi)相關(guān)的基因表達(dá)，COR基因在植物受低溫誘導(dǎo)下是持續(xù)表達(dá)的，而CBF基因的表達(dá)是瞬時產(chǎn)生的，CBF基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能作為低溫反應(yīng)中信號傳遞的一個早期的信號放大事件，其體內(nèi)葉綠素、可溶性糖、游離脯氨酸的含量都明顯高于正常生長下的植株，說明CBF基因促進(jìn)功能蛋白的合成，激發(fā)其調(diào)節(jié)的下游COR基因的表達(dá)積累［11］。

2）由ICE1→CBF→COR組成的低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)在植物低溫馴化過程中發(fā)揮著重要的作用。油菜中與擬南芥AtCOR15同源的基因還沒有克隆得到，根據(jù)已經(jīng)克隆得到的植物COR15基因序列，從隴油6號油菜克隆得到了全長390 bp的COR基因編碼區(qū)，測序結(jié)果與已獲得的油菜COR基因CDS區(qū)序列是完全一致的，同時對該基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并得到了體外表達(dá)產(chǎn)物。下一步將對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，以純化產(chǎn)物為抗原制備COR蛋白抗體，對該基因的功能在蛋白水平做進(jìn)一步研究。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）

Cloning and Prokaryotic Expression of Brassica campestris COR Gene

ZHANG Teng-guo1，GUO Yan-feng1，CHEN Qiong-qiong1，XIA Xiao-hui2
（1.School of Life Sciences，Northwest Normal University，Lanzhou Gansu 730070，China；2.Lanzhou City University，Lanzhou Gansu 730070，China）

Afull-length ofCOR gene is cloned byRT-PCR fromLongyou 6（Brassica campestris L.），the gene encodingarea of COR is 390 bp.It is connected with the E.coli expression vector pET-30a.A recombinant prokaryotic expression vector pET30a-COR is constructed and transformed into E.Coli BL21，after IPTG induction，SDS-PAGE showed that the gene express an approximately 14.3 kDprotein.For the further studyon the structure and function oftarget protein provides an experimental basis.

Longyou 6；COR gene；Cloning；Prokaryotic expression

Q753；S565.4

A

1001-1463（2015）04-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.001

2015-03-31

國家自然科學(xué)基金（31460099、31160089）；甘肅省自然科學(xué)基金（1208RJZA268）

張騰國（1971—），男，甘肅會寧人，教授，博士，主要從事抗逆生理及分子生物學(xué)研究工作。E-mail：zhangtengguo@163.com