李麗，熊思馳，黃飛，王國盼，韋春葵，蘇宏飛，梁智群，黃時海，*

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.南寧高新區(qū)人才交流中心，廣西南寧530007）

L-苯丙氨酸解氨酶產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體誘變育種

李麗1，熊思馳1，黃飛2，王國盼1，韋春葵1，蘇宏飛1，梁智群1，黃時海1，*

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.南寧高新區(qū)人才交流中心，廣西南寧530007）

原始菌株海洋紅酵母M1202產(chǎn)生的L-苯丙氨酸解氨酶（PAL），能夠逆反應(yīng)催化反式肉桂酸（t-Ca）生成L-苯丙氨酸。對M 1202進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變獲得一株轉(zhuǎn)化率為原始菌株115%的菌株TM2，經(jīng)6次傳代，仍具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

海洋紅酵母；L-苯丙氨酸解氨酶；原生質(zhì)體誘變

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）是具有特殊生物活性的芳香族氨基酸，為人和動物不能合成的8種必須氨基酸之一，被廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代新型藥物中[1]。它與L-天冬氨酸縮合，可以生產(chǎn)新型保健甜味劑阿斯巴甜（Aspartame，APM）[2]。而目前阿斯巴甜被認(rèn)為是一種非常安全的二肽甜味劑[3]，適合在肥胖及糖尿病人中使用[4]。自20世紀(jì)80年代以來，隨著氨基酸類抗癌藥物及營養(yǎng)保健品的開發(fā)應(yīng)用，國際市場對L-苯丙氨酸的需求快速增長[5]。其制備方法，歸納起來共有4種：蛋白水解法，化學(xué)合成法，酶轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法[6-7]。其中酶轉(zhuǎn)化法工藝簡單，產(chǎn)物濃度較高，純化步驟簡便且生產(chǎn)能力較強(qiáng)，為目前工業(yè)化生產(chǎn)L-苯丙氨酸的主要方法之一。而酶法制備中研究較多的是利用紅酵母中的L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）逆反應(yīng)催化反式肉桂酸（t-Ca）生成L-苯丙氨酸。

本試驗采用海洋紅酵母的L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）生產(chǎn)L-苯丙氨酸。為了獲得高產(chǎn)菌株，對原始菌株海洋紅酵母M1202進(jìn)行紫外誘變。考慮到原生質(zhì)體對紫外線較敏感，先將M1202制備成原生質(zhì)體，紫外誘變后進(jìn)行原生質(zhì)體再生培養(yǎng)，利用類似物選擇培養(yǎng)基對再生菌株進(jìn)行篩選，以期獲得抗反饋調(diào)節(jié)高水平PAL酶源的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

紅酵母菌M1202由實驗室自主篩選保藏。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（g/L）：10°Bx麥芽汁，瓊脂20.0，pH 5.5。

種子培養(yǎng)基：10°Bx麥芽汁，pH 5.5。

再生高滲培養(yǎng)基（g/L）：10°Bx麥芽汁，0.8mol/L的甘露醇，瓊脂20.0，pH 5.5。

菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：10°Bx麥芽汁，酵母膏1.5，L-Phe 1.0，K2HPO41.0，pH5.5。

選擇培養(yǎng)基（g/L）：L-Tyr 0.5，（NH4）2SO420.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.06，CaCl20.02，LiCl0.5，瓊脂20.0，pH 5.5。

類似物篩選培養(yǎng)基（g/L）：在上述選擇培養(yǎng)基中，按表1添加結(jié)構(gòu)類似物DL-Phe和M-OH-Ca（間羥基反式肉桂酸）。

1.1.3 主要試劑

預(yù)處理液：1%EDTA，0.1%巰基乙醇，用50mmol/L Tris-HCl配制。

原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑：0.5mol/L蔗糖，10mmol/LMgCl2，50mmol/LTris-HCl，pH7.0。

表1結(jié)構(gòu)類似物添加配比Table1 The ratio of DL-phe and M-OH-Ca

紅酵母去壁酶液：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蝸牛酶的原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑，微孔濾膜過濾除菌。

轉(zhuǎn)化液：15g/L反式肉桂酸（t-Ca），Triton-1000.1%（體積分?jǐn)?shù)），氨水濃度6.87 mol/L，碳酸氫銨濃度0.93mol/L，調(diào)pH至10.5。

生理鹽水：稱取9 g NaCl溶解于一定的蒸餾水后定容至1 L，滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞懸液的制備

用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取一環(huán)菌體，接種于種子培養(yǎng)基，于30℃、160 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)20 h～24 h，至對數(shù)生長期。取發(fā)酵液10mL，4 000 r/min離心10min，滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次，將菌體懸浮于10mL穩(wěn)定劑中制備成細(xì)胞懸液。取0.5mL，用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后用平板菌落計數(shù)法測細(xì)胞懸液濃度。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備與再生[8-9]

取5m L細(xì)胞懸液，4 000 r/min離心10min，棄上清液，加入預(yù)處理液，靜置15min，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次，離心10min棄上清液，然后加入5mL酶液，30℃震蕩保溫，顯微鏡記錄原生質(zhì)體數(shù)量。吸取0.5m L酶處理液，加入4.5mL原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑，成原生質(zhì)體懸液后經(jīng)適當(dāng)稀釋，再用再生高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)。另取0.5m L酶處理液至4.5m L無菌水中，震蕩搖勻，適當(dāng)稀釋后，用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)。計算原生質(zhì)體制備率和再生率：原生質(zhì)體制備率（%）=（酶解前菌落數(shù)-固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）/酶解前菌落數(shù)× 100%；原生質(zhì)體再生率（%）=（再生高滲固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)-固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）/（酶解前菌落數(shù)-固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）×100%。

1.2.3 原生質(zhì)體紫外誘變[10]

將制備好的原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋至5× 103個/mL，取5mL移入直徑9 cm的培養(yǎng)皿，并置于已預(yù)熱30min的15w紫外燈下，距離20 cm。磁力攪拌下，分別照射20、40、60、80、100、120、140、160、180 s。取0.2mL照射后的菌液涂布于再生培養(yǎng)基上，30℃下倒置避光培養(yǎng)一周。整個過程需在黑暗或紅光中進(jìn)行，防止光復(fù)活。觀察菌落形態(tài)，統(tǒng)計平板中的菌落數(shù)量，計算致死率，以未經(jīng)誘變處理的菌懸液涂布平板作對照。

1.2.4 初篩

挑取直徑大、長勢稠厚的再生單菌落接種到類似物篩選培養(yǎng)基I、II上，30℃培養(yǎng)72 h。將類似物篩選培養(yǎng)基上菌落直徑大、長勢稠厚的單菌落接種于5mL種子培養(yǎng)基，30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)20 h，再以4%的接種量接種至5mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)30 h。離心得菌體，加入2m L轉(zhuǎn)化液，于30℃、50 r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)12 h。離心取上清，紫外-分光光度法檢測轉(zhuǎn)化率[11]。選取轉(zhuǎn)化率較高的突變菌株斜面保藏，用于下一步復(fù)篩。

1.2.5 復(fù)篩

方法與初篩方法基本一致，采用高相液相色譜法檢測L-Phe含量。

1.2.6 反式肉桂酸轉(zhuǎn)化特性的研究

轉(zhuǎn)化率的測定：取5mL發(fā)酵液，離心棄上清，加入2mL轉(zhuǎn)化液，于30℃，50 r/min反應(yīng)12 h。沸水浴10min鈍化，5 000 r/min離心10min，取上清液0.1mL，稀釋2 500倍，測定溶液OD271。

產(chǎn)酸量的測定：高相液相色譜法（HPLC），C18柱（4.6mmid×250mm），流動相為甲醇-水（體積比為30∶70），流速0.65mL/min，UV檢測波長210 nm。

1.2.7 菌株連續(xù)轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性研究

取培養(yǎng)至產(chǎn)酶階段的125 g濕細(xì)胞，用生理鹽水洗滌，加入250m L轉(zhuǎn)化液，在不添加任何穩(wěn)定劑的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化12 h，測定轉(zhuǎn)化率和L-Phe含量。通過計算t-Ca的轉(zhuǎn)化量，向反應(yīng)液中添加t-Ca使其回復(fù)到反應(yīng)初始時的t-Ca濃度，并用濃氨水和碳酸氫銨調(diào)節(jié)維持反應(yīng)液的pH為10.0。再次轉(zhuǎn)化12 h，并多次重復(fù)上述過程，研究菌株多批次連續(xù)轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備率及再生率測定

原生質(zhì)體的制備率為73.5%，再生率為13.0%。

2.2 原生質(zhì)體紫外誘變

將經(jīng)過紫外照射處理不同時間的菌懸液涂布于再生平板上，采用平板計數(shù)法計算菌落數(shù)，其致死率曲線如圖1所示。

從圖1可知，致死率隨紫外照射時間的延長而增加，140 s時達(dá)到99%，之后基本穩(wěn)定。當(dāng)紫外照射時間為120 s，致死率為90%，菌體正誘變率最大。因此確定紫外誘變的最佳時間為120 s。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Lethality curve of strain induced by UV

2.3 L-Phe標(biāo)準(zhǔn)曲線與t-Ca標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

L-Phe標(biāo)準(zhǔn)曲線與t-Ca標(biāo)準(zhǔn)曲線的見圖2與圖3。

圖2 L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Fig.2 The plotting of standard curve of L-phe

圖3反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Fig.3 The plotting of standard curve of t-Ca

由圖2和圖3可知L-Phe和t-Ca分別在2 g/L～12 g/L、0.03 g/L～0.10 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 初篩

經(jīng)過紫外結(jié)合誘導(dǎo)類似物誘變篩選獲得了106個突變株，挑取其中的65株進(jìn)行初篩，結(jié)果見表2。

表2初篩結(jié)果Table2 The results of preliminary screening

經(jīng)過初篩得到了5株優(yōu)于出發(fā)菌株的突變株，其生物轉(zhuǎn)化能力比較見表3。

表3 誘變株和出發(fā)菌株（M 1202）PAL生物轉(zhuǎn)化能力比較Table3 The PAL bioconversion capacity comparison between the original strain（M 1202）and the mutant strains by UV mutagenesis

從表3中可知，突變株DM1，DM2，TM1，TM2，TDM的轉(zhuǎn)化率均大于68%，較出發(fā)菌株M1202高。

2.5 復(fù)篩

對初篩得到的五株轉(zhuǎn)化率較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩，利用HPLC測定苯丙氨酸含量，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)篩結(jié)果Table4 The results of rescreening

從表4可知，TM2的產(chǎn)酸量最高，達(dá)9.67 g/L。2.6 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定

HPLC分析L-Phe與t-Ca的標(biāo)準(zhǔn)混合液及轉(zhuǎn)化液，結(jié)果顯示，混標(biāo)樣和轉(zhuǎn)化液中的L-Phe與t-Ca分離效果較好，t-Ca保留時間約為6.78min，L-Phe保留時間約為11.34min，峰型對稱且無明顯干擾峰，說明酵母細(xì)胞通過催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中的t-Ca和NH3合成了L-Phe。

2.7 遺傳穩(wěn)定性實驗

TM2經(jīng)過6次連續(xù)傳代，產(chǎn)酸量基本保持穩(wěn)定，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4。

2.8 菌株連續(xù)轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性的研究

結(jié)果如圖5和圖6所示。

經(jīng)過120 h的10次連續(xù)轉(zhuǎn)化，L-Phe積累量達(dá)63.80 g/L。第九次取樣測定時（108 h），轉(zhuǎn)化率降至約40%。與出發(fā)菌株M1202比較（半衰期約為70 h），TM2半衰期有了一定程度的提高。此外，這種連續(xù)補(bǔ)料與分批轉(zhuǎn)化相比，省略了多次離心的步驟，十分有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 菌株TM2的遺傳穩(wěn)定性實驗Fig.4 The genetic stability experiment of strain TM2

圖5 轉(zhuǎn)化10次對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The effect of conversion rateby transform ing ten times

圖6 轉(zhuǎn)化10次的苯丙氨酸積累量Fig.6 The accumulation of L-Phe by transforming ten times

3 結(jié)論與討論

1）紫外線產(chǎn)生的高能射線，直接作用于菌株DNA，引起堿基互補(bǔ)配對出錯，從而導(dǎo)致菌體突變。此外，紫外誘變還具有正突變率較高、不易產(chǎn)生回復(fù)突變的特點[12]，故常被用于微生物誘變育種。本實驗將菌體制備成原生質(zhì)體后再進(jìn)行紫外誘變，去壁后的紅酵母由于失去了細(xì)胞壁的保護(hù)，對紫外線更加敏感，從而提高了突變率。顧蕾[10]等對一株產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母ns-1進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變，獲得類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高的突變菌株UVss，其生物量、色素產(chǎn)量分別比原始菌株提高了67.6%、54.1%。我們的實驗結(jié)果也表明，原生質(zhì)體紫外誘變與常規(guī)方法相比，在提高海洋紅酵母PAL酶活、轉(zhuǎn)化率等方面效果較好。比如，本實驗誘變的TM2菌株的穩(wěn)定性明顯高于目前報道的其它微生物[13]。

2）本試驗在篩選培養(yǎng)基中添加了結(jié)構(gòu)類似物DL-苯丙氨酸（DL-Phe）和間羥基反式肉桂酸（M-OHCa），建立了高通量的篩選方法。DL-Phe為PAL非天然底物，具有較高的Km值，作為唯一碳源時能誘導(dǎo)出高水平的PAL[14-15]；M-OH-Ca是PAL反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物，添加時迫使PAL酶源菌株產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)，從而阻遏PAL的生成和影響菌體的生長、代謝。因此，添加M-OH-Ca能輔助篩選出高抗反饋調(diào)節(jié)的PAL酶源菌株。本實驗結(jié)果表明，該高通量方法簡單、高效、省時和低成本，并可用于再生原生質(zhì)體的篩選。

3）采用改良的轉(zhuǎn)化方式，分批連續(xù)補(bǔ)料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，省略了多次離心步驟。連續(xù)10次補(bǔ)料，250mL轉(zhuǎn)化液共加入25 g t-Ca，相當(dāng)于底物濃度為100 g/L。經(jīng)120 h轉(zhuǎn)化，L-Phe積累量達(dá)63.80 g/L，即轉(zhuǎn)化率達(dá)63.80%，這為下一步優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)大實驗規(guī)模，奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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Mutation Breeding of Protoplast of L-phenylalanine Ammonia-lyase Producing Strains

LI Li1，XIONG Si-chi1，HUANG Fei2，WANG Guo-pan1，WEI Chun-kui1，SU Hong-fei1，LIANG Zhi-qun1，HUANG Shi-hai1，*
（1.Life Science and Technology College，Guangxi University，Nanning 530005，Guangxi，China；2.the Communication Centre for Talents of Nanning New and High-tech Industrial Development Zone，Nanning 530007，Guangxi，China）

Using Rhodotorula benthica M1202 as the original strain，the L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）of M1202 could transform trans-Cinnamic acid（t-Ca）to L-phenylalanine.The aim of this study was to obtain new Rhodotorula benthica mutants with high conversion rate.UV induced mutagenesis of protoplast was performed on original strain Rhodotorula benthica M1202.A genetically stable mutant strains TM2was selected from a large amount of the regenerative mutants.The conversion rate of TM2was1.15-fold increased compared with its original strain.Further experiment confirmed after six generations successively propagating the conversion rate of TM2 was stable.

Rhodotorula benthica；L-phenylalanine ammonia-lyase；protoplast mutation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.029

2013-07-29

南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（20125193）；梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（201201023）

李麗（1988—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品與發(fā)酵工程。

*通信作者：黃時海，男，博士，食品與發(fā)酵工程專業(yè)。