史龍梅，李歡，周建科

（河北大學理化分析中心，河北省分析科學技術重點實驗室，河北保定071002）

固相萃取-液相色譜測定葡萄干中防腐殺菌劑

史龍梅，李歡，周建科*

（河北大學理化分析中心，河北省分析科學技術重點實驗室，河北保定071002）

以無水硫酸鈉為分散劑，固相分散萃取葡萄干中噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺4種防腐殺菌劑，C18固相萃取小柱凈化處理，高效液相色譜法測定。反相C18色譜柱分離，乙腈-甲醇-水（50∶10∶40，體積比）為流動相，檢測波長225 nm。在0.01μg/mL～200μg/mL范圍內(nèi)4組分線性關系良好，相關系數(shù)大于0.999 3，方法檢出限為2.0 ng/g～20.0ng/g，相對標準小于3.18%，方法適合于葡萄干中相關防腐殺菌劑的檢測。

固相萃??；高效液相色譜；噻苯咪唑；三唑醇；滅菌丹；咪酰胺

防腐殺菌劑是用于作物生長后期病害防治或采收后防腐保鮮的一類農(nóng)藥，噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺較為常用，特別是葡萄生長過程中病害的防治[1]，其中咪酰胺本身屬低毒農(nóng)藥，但其最終代謝產(chǎn)物2，4，6–三氯酚，被眾多國家定為環(huán)境中優(yōu)先控制污染物[2]。水果蔬菜中防腐殺菌劑殘留的危害已引起人們的高度關注，其毒性和殘留對人體健康產(chǎn)生不利影響，甚至出現(xiàn)致癌、致畸、致突變的情況[3-4]，因此，研究葡萄干中多種防腐殺菌農(nóng)藥殘留檢測方法具有重要意義。

文獻報道防腐殺菌劑殘留的檢測方法，主要有高效液相色譜、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、分光光度法和免疫分析法等[5-8]。目前關于防腐殺菌劑測定的樣品前處理方法主要有基質(zhì)固相分散、固相萃取、液液分散微萃取等[9-11]，對于痕量組分分析，樣品的預處理至關重要。

固相分散萃?。⊿PDE）是在基質(zhì)固相分散萃?。∕SPDE）基礎上發(fā)展起來的，與后者相比，不用裝柱，操作簡單。周建科等[12]，采用該方法處理花生醬樣品，測定了苯甲酸和山梨酸2種食品防腐劑。本實驗采用該方法提取葡萄干中4種防腐殺菌劑，C18固相萃取小柱進一步凈化，建立了固相分散萃取C18小柱凈化、反相高效液相色譜同時測定葡萄干中噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺4種防腐殺菌劑的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-10AT液相色譜儀：7725i型手動進樣閥，SPD-10A紫外檢測器，N-2000型雙通道色譜工作站（浙江大學智能信息工程研究所）；SZ-93自動雙重純凈水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；Varian Bond Elut C18固相萃取小柱。

噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺購于DIKMA公司；甲醇和乙腈均為色譜純，所用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純，新疆吐魯番普通級葡萄干，購自當?shù)爻小?/p>

標準儲備溶液：準確稱取噻苯咪唑、三唑醇、滅菌丹、咪酰胺，噻苯咪唑用甲醇溶解、其余均用乙腈溶解定容，配制成濃度均為1mg/mL的標準儲備液。用乙腈逐級稀釋標準儲備液，配制系列工作溶液，冰箱4℃冷藏。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；柱溫：室溫；流動相：乙腈-甲醇-水體積比為=50∶10∶40；紫外檢測波長：225 nm；流速1.0mL/min；進樣量：10μL。采用色譜峰保留時間定性，外標法峰面積定量。標準溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

1.3 樣品處理

葡萄干剪碎，準確稱取2 g于研缽中，加入5 g無水硫酸鈉混合研磨，使葡萄干充分脫水并分散均勻后將其轉入離心管，加入9mL甲醇和乙腈混合萃取劑（v/v=1∶1），充分振搖，離心5min（3 000 r/min），上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，置于10m L具塞錐形刻度管中，待C18固相萃取小柱凈化。

C18柱先用2m L甲醇活化，取樣品濾液混勻上樣，控制流速1mL/min，得到洗脫液8.0mL，移取2mL濾液在溫水中用微氮氣流濃縮至0.2mL，取10μL進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 分散劑用量選擇

本實驗采用無水硫酸鈉作分散劑。當葡萄干樣品量為2 g時，分別考察了2 g～7 g無水硫酸鈉作分散劑對樣品的分散能力和回收率的影響情況，如圖2所示。

圖2 分散劑用量的影響Fig.2 Influence of dispersion medium amount

結果表明，當無水硫酸鈉為5 g時，樣品分散均勻，回收率較高。故選擇分散劑的用量為5 g。

2.1.2 萃取劑的選擇

由于4種防腐殺菌劑的溶解情況存在差異，很難用單一溶劑全部有效萃取，實驗最后選定甲醇∶乙腈= 1∶1（v/v）混合溶劑作為萃取劑?？疾炝溯腿┯昧繉厥章实挠绊懬闆r，如圖3所示。

圖3 萃取劑體積的影響Fig.3 Influence of extractant volume

結果表明，萃取劑的體積為9mL時，有最好的萃取效率。

2.1.3 固相萃取小柱的選擇

基質(zhì)固相分散甲醇萃取后，雜質(zhì)峰較多，干擾目標化合物測定，必須進一步凈化處理。分別考察了Florisil自裝柱和市售Varian Bond ElutC18固相萃取柱對葡萄干中4種防腐殺菌劑殘留的凈化洗脫情況。結果表明，過Florisil自裝柱后仍存在干擾且回收率低；而Varian Bond ElutC18固相萃取小柱，可有效截留住干擾組分，回收率也相對理想。故選擇Varian Bond ElutC18固相小柱凈化處理。

2.2 線性方程及檢出限

將標準溶液逐級稀釋，配制成一系列濃度的工作液，在所選的色譜條件下，以Y（峰面積）對X（質(zhì)量濃度）繪制工作曲線，四組份的線性方程、相關系數(shù)及方法檢出限見表1。

表1 線性方程、相關系數(shù)和方法檢出限Table1 Linear equations，correlation coefficients and detection limits

2.3 加標回收率和精密度

于2 g葡萄干樣品，加入適量標準溶液，在最佳萃取條件和色譜條件下，測定加標后四組分的含量，平行測定6次，計算相應的回收率和精密度，結果見表2，樣品加標色譜圖見圖4。

表2 樣品加標回收率和精密度Table2 Recoveries and precision（n=6）

圖4 樣品加標色譜圖Fig.4 Chromatogram of spiked sample

2.4 實際樣品測定

取2 g葡萄干樣品，在最佳萃取條件和色譜條件下測定，平行測定3次，實際樣品色譜圖如圖6所示，四組分均未檢出。

圖6 實際樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of the real sample

3 結論

采用固相分散萃取提取、C18小柱凈化、高效液相色譜法同時測定葡萄干中4種防腐殺菌劑。無水硫酸鈉分散劑可有效破壞葡萄細胞和去除水分具有很好的分散效果，C18固相萃取柱凈化效果良好，方法適合于葡萄干中相關防腐殺菌劑的測定。

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Determination of Preservatives and Bactericides in Raisins by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography

SHI Long-mei，LI Huan，ZHOU Jian-ke*
（Research Center of Physics and Chemistry Analysis，Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

With anhydrous sodium sulfate as dispersant，F(xiàn)our kinds of preservatives and bactericides in raisins were extracted by solid phase dispersion method，the C18 solid phase extraction small column was used for purification.Thiabendazole，Baytan，F(xiàn)olpet and Prochloraz were separated by reversed-phase high performance liquid chromatography with C18 column.The mobile phase was the mixture of acetonitrile，methanol and water（50∶10∶40，v/v）and detection wavelength was 225 nm.The linearity of regression equations were good in the range of 0.01μg/mL-200μg/mL，with correlation coefficients were greater than 0.999 3.Limit of detection is2.0 ng/g-20.0 ng/g.The relative standard deviations（RSD）were less than 3.18%．This method is suitable for the analysis of relevant preservatives and bactericides in raisins.

SPE；HPLC；thiabendazole；baytan；folpet；prochloraz

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.027

2013-11-14

史龍梅（1988—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：色譜分離分析。

*通信作者：周建科（1956—），男，研究員，碩士生導師。