杜鵑，吳忠紅

（1.新疆農業(yè)職業(yè)技術學院園林科技學院，新疆昌吉831100；2.新疆農業(yè)科學院，農產品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

新疆昆侖雪菊總黃酮含量測定方法研究

杜鵑1，吳忠紅2

（1.新疆農業(yè)職業(yè)技術學院園林科技學院，新疆昌吉831100；2.新疆農業(yè)科學院，農產品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

以蘆丁為標準品，對NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法測定新疆昆侖雪菊總黃酮含量的結果作了比較。結果表明：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的測定結果比AlCl3法對于高原雪菊和平原雪菊分別約高19.76mg/mL和9.34mg/m L，AlCl3法適宜酸度為pH>5.5。鄰苯二酚干擾實驗表明，平均誤差為0.019mg/L，隨著鄰苯二酚量的增加，測得值無上升趨勢。AlCl3法的線性方程為：A=0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2。因此，對含酚類、酸類較多的昆侖雪菊應采用三氯化鋁法測定其總黃酮的含量。

雪菊；黃酮；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法；AlCl3法

雪菊[1-2]是生長在新疆和田部分山區(qū)，海拔3 200m以上的雪山之隅及喀喇昆侖山脈的野生蛇目菊，所以又稱昆侖雪菊、天山雪菊，是目前新疆惟一與雪蓮齊名，具有獨特功效的稀有高寒植物。長期以來，昆侖雪菊被和田當?shù)鼐用癞敾ú栾嬘茫芍委熢餆釤┛?、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒。

黃酮含量測定的方法有多種，其中絡合法在黃酮測定使用較普遍，可以克服被測液基底的影響，但是與被測液成分有很大關系，絡合劑及酸度的選擇非常重要。目前對雪菊的研究甚少，尤其是化學成分方面。有學者[3]采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測定了雪菊中黃酮活性物質，據(jù)報導[4-5]雪菊中還含有綠原酸、鄰苯二酚等具有鄰苯二羥基結構，堿性環(huán)境下與鋁離子形成絡合物，可能會對黃酮的測定造成干擾，影響總黃酮的測定。本實驗分別用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法比較雪菊總黃酮含量測定結果，期望建立一種簡單、快速測定新疆昆侖雪菊中總黃酮含量的方法，以期為昆侖雪菊質量控制和開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與來源

1.1 材料

采自2個不同地點的昆侖雪菊樣品分別為新疆和田皮山縣克里陽高原雪菊（生長海拔3 200m左右）、新疆達坂城平原雪菊（生長海拔1000m左右）。

1.2 化學試劑

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鋁、醋酸、醋酸鈉、乙醇、氨水、鹽酸、醋酸鉛、鎂粉均為分析純、蘆丁（標準品）上海金穗生物有限公司。

1.3 儀器設備

FA2004電子天平：上海儀器天平廠；722型可見分光光度計：上海光譜儀器分析有限公司；PHS-3C-11A型精密pH計：中國上海雷磁新涇儀器公司；KS-300EⅡ型超聲波清洗機：寧波海曙科生超聲設備有限公司；Edwards Pirani1001冷凍干燥器（U.K.）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。

2 方法

2.1 供試樣品溶液的制備

采用超聲波提取法[6-7]。將2種雪菊樣品粉碎，過60目篩，分別稱取干燥的昆侖雪菊粉各5 g，加95%乙醇50mL，于超聲波清洗機中提取10min，趁熱減壓抽濾，用80%乙醇定容至100mL，搖勻后再稀釋5倍即得樣品溶液。

2.2 黃酮類成分的定性實驗[8]

2.2.1 鹽酸—鎂粉反應

分別取2種雪菊色素提取液5mL，加入少許鎂粉，振蕩后，再加入2滴36%鹽酸，觀察顏色變化。

2.2.2 中性醋酸鉛反應

分別取2種雪菊色素提取液5mL，逐漸滴加新配制的飽和中性醋酸鉛溶液，觀察顏色變化。

2.2.3 濃氨水試驗

分別用2種雪菊色素提取液點在紙上，用濃氨水熏蒸，紫外燈下觀察。

2.3 蘆丁標準品溶液的配制

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品105.8mg，置100mL容量瓶中，用少量甲醇加熱溶解，冷卻后甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.058mg/mL的蘆丁標準品溶液。

2.4 兩種黃酮含量的測定方法

2.4.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[9]測定雪菊總黃酮含量

分別吸取上述蘆丁標準液0.00、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，用50%乙醇稀釋至5.00m L，分別加入5%NaNO2，試液0.3m L，搖勻，靜置6min。再加5%A1（NO）3試液0.3mL，搖勻，靜置6min，再加4%NaOH4ml，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置12min。于510 nm[10]處測試，以顯色液中蘆丁的濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測定雪菊中總黃酮含量的標準曲線見圖1，用最小二乘法進行回歸，得線性方程：A= 0.004 71C+0.0136，r2=0.999 5。線性范圍為5.9μg/mL～59μg/mL。

取1.0m L樣品溶液10m L容量瓶，以不加樣品溶液為空白，按“2.4.1項”下的條件測定吸光度，參照標準曲線計算濃度，平行測定3次取其平均值。

2.4.2 AlCl3法測定雪菊中總黃酮含量

分別精密吸取上述蘆丁標準液0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0m L于25m L的比色管中，加入1.5%AlCl38mL和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH5.5）4mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h。于415 nm下測試，以吸光度值為縱坐標，以顯色液中蘆丁的濃度為橫坐標，AlCl3法測定雪菊中總黃酮含量的標準曲線見圖2，用最小二乘法進行回歸，線性方程為A= 0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2。

圖2 AlCl3法蘆丁標準曲線Fig.2 A lC l3method of rutin standard curve

取1.0m L樣品溶液10m L容量瓶，以不加樣品溶液為空白，按“2.4.2項”下的條件測定吸光度，參照標準曲線計算濃度，平行測定3次取其平均值。

2.5 干擾實驗

為了保證測定結果不受酚類物質影響，做如下實驗：以蘆丁為被測試樣，鄰苯二酚為干擾劑（鄰苯二酚是雪菊中酚類物質的代表之一，含有鄰位多羥基），按標準曲線的測定方法測定，準確移取0.1mg/mL蘆丁3.0mL 7份，分別準確加入0.1 g/L鄰苯二酚溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL，再依次加入8mL 0.1mol/L AlCl3和4mL醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH5.5），用50%乙醇溶液定容。

2.6 酸度對測定結果的影響

分別配制 pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，吸取2mL 0.1 g/L蘆丁標準溶液和1．5%AlCl38mL 5份，分別加入不同pH的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，50%乙醇溶液定容。

3 結果分析

3.1 黃酮類成分的定性實驗

經鹽酸-鎂粉反應、中性醋酸鉛實驗、濃氨水反應檢驗，均呈陽性。根據(jù)本實驗及有關資料證實，新疆昆侖雪菊的乙醇提取液中確實存在黃酮類成分。

3.2 兩種黃酮測定方法的比較

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法與AlCl3法測定結果見表1。

表1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和A lC l3法測定結果比較Table1 Com parison of NaNO2-Al（NO3）3-NaOHmethod and AlC l3method for the determination of results

由表1可知，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的測定結果偏高，和田高原雪菊和達坂城平原雪菊的測定結果分別高出19.76mg/m L和9.34mg/m L，而用AlCl3法兩種雪菊測定得出的結果則相對偏低。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法源于蘆丁含量測定法，并逐步用于黃酮類化合物的測定。后來發(fā)現(xiàn)這并不是黃酮類化合物的專屬反應，因為凡具有鄰苯二羥基的物質，均能用此法進行顯色測量。雪菊中含有鄰苯二酚及花色素等多酚類物質，這些物質都具有鄰苯二羥基結構，顯色反應后在510 nm有很強吸收，顯然會對黃酮的測定造成干擾，所以該法測定結果偏高。A1C13法在酸性環(huán)境下，只與酮羰基和其鄰位羥基發(fā)生絡合，反應如下所示。

A1C13法測定時，蘆丁、黃芪苷、槲皮素等黃酮類物質反應強烈，而對酚酸類、原花色素的反應很小，該法對黃酮類化合物的專屬性較強，適用于雪菊黃酮含量的測定，因此，選用A1C13法對雪菊中的黃酮進行定量測定較適宜。

3.3 干擾實驗

不同添加量的鄰苯二酚對實驗結果的影響見表2。

表2 不同添加量的鄰苯二酚對實驗結果的影響Table 2 Effects of adding different amount of catechol on experimental results

由表2可見，測得量與實際量略有差異，平均誤差0.019mg/mL。但隨著鄰苯二酚的增加，測得值無上升趨勢，因此用AlCl3法測定雪菊中黃酮的含量，不受酚和酸類物質的影響。

3.4 酸度對測定結果的影響

實驗表明，隨著酸度的降低，最大吸收峰位置逐漸紅移，pH大于5時，最大吸收峰位置穩(wěn)定，位于415nm；吸光度值最高并且穩(wěn)定。用酸度計對緩沖溶液和發(fā)色后的測試液進行測試，發(fā)現(xiàn)pH大于5.5時，測試液與緩沖溶液的差值最小。實驗選定pH 5.5作為測定用緩沖溶液。

4 結論

本實驗用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法測定新疆昆侖雪菊總黃酮含量的結果作了比較。結果表明，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的測定結果比AlCl3法對于高原雪菊和平原雪菊分別約高19.76mg/mL和9.34mg/mL，AlCl3法在酸性環(huán)境下進行，酸度實驗顯示，適宜酸度為pH>5.5。鄰苯二酚干擾實驗表明，平均誤差為0.019mg/mL，隨著鄰苯二酚量的增加，測得值無上升趨勢。AlCl3法的線性方程為：A=0.000 638+ 0.862 3C，r2=0.999 2。因此，對含酚類、酸類較多的昆侖雪菊應采用三氯化鋁法測定其總黃酮的含量。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草，維吾爾藥卷[M].上海:上?？茖W技術出版社,2005:992

[2]江蘇省植物研究所,中國醫(yī)學科學院藥物研究所等.新華本草綱要[M].上海:上?？茖W技術出版社,1988

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Study on Determination of Total Flavonoids Content in Xinjiang Kunlun Snow Chrysanthemum

DU Juan1，WU Zhong-Hong2
（1.Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Institute of Science and landscape architecture，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Urumqi830091，Xinjiang，China）

With rut in as the standard substance，comparing the NaNO2-Al（NO3）3-NaOH determination of total flavonoids content in Xinjiang Kunlun snow chrysanthemum method and AlCl3method.The results showed that：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH assay results than the AlCl3method for the Plateau snow chrysanthemum and plain snow chrysanthemum was approximately 19.76mg/mL and 9.34 mg/mL，AlCl3acidity was pH>5.5.The experiment showed that the catechol interference，the average error was0.019mg/L，with the increase of the measured value of catechol，no upward trend.Linear equation AlCl3method was A=0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 2.Therefore，determination of the total flavonoids of phenols，acids more Kunlun snow chrysanthemum should be adopted AlCl3method.

snow chrysanthemum；flavonoids；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method；AlCl3method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.024

2014-01-17

自治區(qū)高?？蒲杏媱濏棧╔JEDU2013S52）

杜鵑（1979—），女（漢），講師，碩士，從事食品加工教學及研究工作。